杜鵬 頓寶生 楊新杰 彭修娟

摘要 目的：評(píng)價(jià)高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器法（HPLC-ELSD）黃七膠囊中黃芪甲苷的含量測(cè)定。方法：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水（32∶68）為流動(dòng)相；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；柱壓11.2～12.3 MPa；流速：1.0 mL/min；柱溫：室溫。理論塔板數(shù)以黃芪甲苷峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000；峰拖尾因子為1.02。結(jié)果：HPLC-ELSD法精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、回收率良好。黃芪甲苷對(duì)照品進(jìn)樣量在1.0528～10.528 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 9，n=7）。結(jié)論：高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器測(cè)定黃七膠囊中黃芪甲苷含量是可行的。

關(guān)鍵詞 黃七膠囊；高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器法；黃芪甲苷

Abstract Objective：To evaluate contents of astragaloside in Huangqi Capsules measured by HPLC-ELSD. Methods：The octadecyl silane bonding silica gel was the filler， with acetonitrile-water （32∶68） as mobile phase， and the detector was ELSD with the column pressure of 11.2～12.3 MPa and the flow rate of 1.0 mL/min. Column temperature： indoor temperature. Theoretical plate number was calculated by puerarin peak which should not be less than 4 000； Trailing factor was 1.02. Results：The method of HPLC-ELSD had good accuracy， repeatability， stability and recovery rate. A good linearity relationship of the sample size of asreagaloside comparison products in the range of 1.0528-10.528 μg （r=0.999 9， n=7）. Conclusion：Contents of astragaloside in Huangqi Capsules measured by HPLC-ELSD is feasible.

Key Words Huangqi Capsules； HPLC-ELSD； Astragaloside

中圖分類號(hào)：R284文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.02.053

中風(fēng)又名“卒中”，其基本病機(jī)為陰陽(yáng)失調(diào)、氣血逆亂、上犯于腦，導(dǎo)致腦脈痹阻或血溢腦脈之外，臨床以卒然昏仆、不省人事、半身不遂、口舌歪斜、語(yǔ)言不利、偏身麻木為主癥的一種疾病[1]。因本病起病急劇，變化迅速，與自然界善行而數(shù)變之風(fēng)邪特性相似，故古人以此類比，名為中風(fēng)[2]。中風(fēng)是中醫(yī)學(xué)中的4大頑疾之一，具有發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高、致殘率高、病死率高的特點(diǎn)，嚴(yán)重危害人民健康的疾病[3]。中風(fēng)初發(fā)時(shí)以風(fēng)證為主；發(fā)病1～2周時(shí)，以痰濕證、血瘀證為多；恢復(fù)期以血瘀證、氣虛證為多[4]?，F(xiàn)代血液流變學(xué)研究表明，中風(fēng)患者血液存在著“濃”（紅細(xì)胞比容增高）、“黏”（全血黏度比、血漿黏度比和纖維蛋白原增高）、“聚”（紅細(xì)胞時(shí)間性泳時(shí)間長(zhǎng)）的情況[5]。故益氣活血法為中風(fēng)、特別是中風(fēng)恢復(fù)期的重要治療法則。

黃七膠囊是在黃七湯的基礎(chǔ)上研制而成，由黃芪、土鱉蟲(chóng)、三七、葛根4味藥材組成，具有益氣活血，化瘀通絡(luò)之功效。用于氣虛血瘀，脈絡(luò)瘀阻所致的中風(fēng)恢復(fù)期，對(duì)半身不遂，肢體麻木，口眼歪斜，言語(yǔ)不清或不語(yǔ)，感覺(jué)減退或消失治療效果良好[6]。方中君藥黃芪是一味常用中藥，具有補(bǔ)氣固表、利尿托毒、排膿、斂瘡生肌之功效。臨床用于氣虛乏力、食少便溏、中氣下陷、久瀉脫肛、便血崩漏、表虛自汗、氣虛水腫、癰疽難潰、久潰不斂、血虛痿黃、內(nèi)熱消渴，慢性腎炎蛋白尿、糖尿病等[7]?，F(xiàn)代研究表明，黃芪皂苷具有減少腦缺血再灌注（I/R）后神經(jīng)元凋亡[8-10]、降低Ca+超載[11-12]、減少活性氧的損傷[13]、減輕炎性反應(yīng)[14]、促進(jìn)修復(fù)[15]等作用，在中風(fēng)恢復(fù)期的抗細(xì)胞損傷和損傷后修復(fù)中發(fā)揮重要作用。在新藥研制過(guò)程中，我們對(duì)黃七膠囊中君藥黃芪的有效成分—黃芪甲苷的高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器法（HPLC-ELSD）含量測(cè)定進(jìn)行方法學(xué)研究，為有效控制黃七膠囊的質(zhì)量奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 P-3000型高效液相色譜儀；ELSD-UM3000型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；Trisep-2003色譜工作站，7725i進(jìn)樣器。

1.2 試藥 10批樣品由楊凌無(wú)為制藥集團(tuán)公司自制，黃芪甲苷對(duì)照品：中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)：110781-200613，供含量測(cè)定用。3批研究用中試樣品，批號(hào)：20100602、20100605、20100608，由該公司膠囊劑車(chē)間生產(chǎn)，乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

2.1.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，柱壓11.2～12.3 MPa；流速：1.0 mL/min；柱溫：室溫。理論塔板數(shù)以黃芪甲苷峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000；峰拖尾因子為1.02。

2.1.2 流動(dòng)相的選擇比例 將乙腈-水溶液的比例分別選為（28∶72）（32∶68）（36∶64）（40∶60），按正文方法用對(duì)照品溶液精密吸取20 μL，作圖，結(jié)果表明，乙腈-水溶液（32∶68）為流動(dòng)相的分離效果最佳。見(jiàn)表1。

2.2 提取溶劑的選擇

黃芪甲苷在甲醇和水中有較好的溶解度，試用水、25%、50%、75%、100%的甲醇超聲提取，進(jìn)行比較，選擇出最佳的提取溶劑。分別稱取樣品（批號(hào)：20100406）5份，（約2.0 g），精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別加入水，25%、50%、75%、100%的甲醇100 mL，超聲處理（功率250 W，頻率35 kHz）30 min，離心（轉(zhuǎn)速為3 000 r/min），取上清液置蒸發(fā)皿中，殘?jiān)謩e用不同濃度的甲醇或水洗滌3次，每次10 mL，洗液并入蒸發(fā)皿中濃縮至干，殘?jiān)铀?0 mL，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇液振搖提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次40 mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)铀? mL使溶解，放冷，通過(guò)D101型大孔吸附樹(shù)脂柱（內(nèi)徑1.5 cm，長(zhǎng)12 cm），以水50 mL洗脫，棄去水液，再用70%乙醇100 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，分別用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。精密吸取對(duì)照品溶液10 μL、20 μL與供試品溶液15 μL，注入液相色譜儀測(cè)定，以外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程計(jì)算，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

上述結(jié)果表明，用50%甲醇提取，黃芪甲苷提取率最高，故選擇50%甲醇作為提取溶劑。

2.3 超聲時(shí)間的確定

分別稱取樣品約2.0 g（批號(hào)：20100406）4份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，分別超聲處理（功率250 W，頻率35 kHz）15、30、45、60 min，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

上述結(jié)果表明，超聲45 min提取效果最佳，故超聲提取時(shí)間確定為45 min。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取濃度為0.5264 mg/mL的黃芪甲苷對(duì)照品溶液2、4、8、12、18、20 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，以Ln峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，Ln含量（X）為橫坐標(biāo)，求得2點(diǎn)對(duì)數(shù)方程：Y=1.374 38X+9.90402，r=0.999 9，n=7。見(jiàn)表4。結(jié)果表明，黃芪甲苷進(jìn)樣量在1.052 8～10.528 2 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取本品（批號(hào)20100406）精密稱定，按正文中供試品制備方法制備樣品，于0、4、8、12、24 h按正文方法測(cè)定，即得。結(jié)果表明，本品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。見(jiàn)表5。

2.6 精密度試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液，在正文色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積，結(jié)果見(jiàn)表6。表明本方法精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)樣品（批號(hào)：20100406）6份，按正文中供試品溶液制備方法制備，按正文方法測(cè)定含量，結(jié)果表明，本方法重復(fù)性良好。見(jiàn)表7。

2.8 回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品（批號(hào)：20100406，含量為0.6427 mg/粒）約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入黃芪甲苷對(duì)照品溶液（濃度為0.596 4 mg/mL）2 mL，加入50%甲醇98 mL，以下皆同正文，依正文方法測(cè)定，以下式計(jì)算回收率：

回收率（%）=測(cè)得總量（mg）-已知樣品含量（mg）加入對(duì)照品的量（mg）×100%。

結(jié)果表明，本方法回收率良好。見(jiàn)表8。

2.9 樣品測(cè)定

按處方量的1/10，分別制備7批樣品，連同成型工藝研究試驗(yàn)的3批樣品，依據(jù)正文中含量測(cè)定方法，進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表9，經(jīng)對(duì)10批樣品中黃芪甲苷的含量測(cè)定，平均值為0.64 mg/粒，考慮到藥材來(lái)源及大工業(yè)生產(chǎn)、貯藏等因素，故暫定本品每粒含黃芪甲苷（C41H68O14）不得少于0.52 mg。

2.10 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

采用黑龍江產(chǎn)的蒙古黃芪投藥，制得的3批中試樣品，批號(hào)：20100602、20100605、20100608，對(duì)該黃七膠囊中黃芪所含黃芪甲苷進(jìn)行了含量測(cè)定。另外，在該處方中取掉黃芪，按正文生產(chǎn)工藝投料制作，制成陰性對(duì)照品，分別進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表10。

以上3批中試樣品均符合規(guī)定，平均測(cè)得值為0.644 mg/粒，含量測(cè)定成分黃芪甲苷的轉(zhuǎn)移率為93.33%，證明該標(biāo)準(zhǔn)所指定的黃芪甲苷含量限度可行，陰性對(duì)照品在相應(yīng)部位未出峰，證明處方中其他藥材對(duì)本含量測(cè)定無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

3 討論

在提取溶劑的選擇試驗(yàn)中，以外標(biāo)兩點(diǎn)對(duì)數(shù)方程計(jì)算，用Ln峰面積/Ln稱樣量為篩選指標(biāo)，優(yōu)選出了最佳提取溶劑為50%甲醇，優(yōu)于中華人民共和國(guó)藥典2010年版一部黃芪藥材中黃芪甲苷含量測(cè)定用甲醇作為提取溶劑[5]。

中華人民共和國(guó)藥典對(duì)黃芪藥材中黃芪甲苷含量測(cè)定采用索氏提取器，加熱回流提取4 h，本實(shí)驗(yàn)采用超聲提取45 min，提取效果最佳，大大節(jié)省了提取時(shí)間，降低了能量的消耗。

HPLC-ELSD法簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確。精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、回收率及線性關(guān)系良好。黃芪甲苷的含量測(cè)定常采用薄層掃描法，但重現(xiàn)性差，且黃芪甲苷只在201 nm處呈現(xiàn)弱的末端吸收，若采用紫外（UV）檢測(cè)器測(cè)定，干擾非常嚴(yán)重。本實(shí)驗(yàn)采用蒸發(fā)光散射（ELSD）檢測(cè)器，對(duì)黃芪甲苷有通用響應(yīng)，能有效的排除干擾。

在本實(shí)驗(yàn)條件下，穩(wěn)定性、精密度、重復(fù)性、線性關(guān)系良好，平均回收率為98.90%（RSD=0.40%），經(jīng)10批樣品及3批中試樣品驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，證明該標(biāo)準(zhǔn)所制定的黃芪甲苷含量限度可行，陰性對(duì)照品在相應(yīng)部位未出峰，說(shuō)明處方中其他藥材對(duì)本含量測(cè)定無(wú)干擾。

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