魏歆然　鄭雪娜　裴蕓　吳雪芬　劉麗　陳小麗　文琪琦　岳增輝　魏高文

〔摘要〕 目的 探討大鼠失眠模型造模中對(duì)氯苯丙氨酸（para-chlorophenylalanine，PCPA）混懸液配制的改良方法，并對(duì)造模效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。方法 98只SD大鼠中50只用NaOH溶液配制法、24只用NaHCO3溶液配制法和24只用改良法進(jìn)行失眠大鼠造模，探討制作PCPA致失眠模型的最佳方法。結(jié)果 NaOH溶液配制法50只大鼠造模失敗，NaHCO3溶液配制法24只大鼠造模失敗，改良法24只大鼠造模成功，且PCPA劑量以0.5 g/kg造模效果最好（P<0.05）。結(jié)論 改良的PCPA混懸液的配制法可以成功制作大鼠失眠模型。

〔關(guān)鍵詞〕 對(duì)氯苯丙氨酸；失眠；造模

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R332 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.09.004

〔Abstract〕 Objective To explore the improved method of preparing para-chlorophenylalanine （PCPA） suspension in a rat model of insomnia， and evaluate the effect of modeling. Methods In the 98 SD rats， 50 rats were treated with NaOH solution preparing method， 24 SD rats were modeled with NaHCO3 solution preparing method， and 24 SD rats were treated with the improved method to establish the model of insomnia rats. Results There were 50 failed model rats with NaOH solution preparing method， 24 failed model rats with NaHCO3 solution preparing method. The 24 model rats succeed by the improved method， and the 0.5 g/kg of PCPA was the best dose to establish the model （P<0.05）. Conclusion The improved preparing method of PCPA suspension can successfully make the rat model of insomnia.

〔Keywords〕 para-chlorophenylalanine； insomnia； model

失眠大鼠模型的制作主要可以分為物理造模法和化學(xué)造模法：物理造模法包括強(qiáng)迫運(yùn)動(dòng)、水平臺(tái)環(huán)境、旋轉(zhuǎn)圓筒睡眠剝奪、水上轉(zhuǎn)盤(pán)法等；化學(xué)造模法是腹腔或皮下注射中樞興奮類(lèi)藥物進(jìn)行部分或全部睡眠剝奪，目前國(guó)內(nèi)外較為常用的失眠造模藥物為對(duì)氯苯丙氨酸（dl-4-chlorophenylalanine，PCPA），是一種5-羥色胺（5-Hydroxytryptamine，5-HT）合成抑制劑，可以抑制大鼠大腦5-HT合成，造成睡眠晝夜節(jié)律消失，幾乎達(dá)到完全失眠[1]，并且造模時(shí)間短， 費(fèi)用較低， 可重復(fù)性好， 但鮮少有文獻(xiàn)詳細(xì)描述PCPA混懸液的配制過(guò)程。本課題組根據(jù)改良PCPA混懸液配置方法成功制作了24只大鼠失眠模型，現(xiàn)將相關(guān)結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD雄性大鼠98只，體質(zhì)量220～250 g/只。由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（湘）2013-0004。

1.1.2 主要藥物與儀器 PCPA由美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)，批號(hào)為SHBC0245V；碳酸氫鈉片由成都市科龍化工試劑廠(chǎng)生產(chǎn)，批號(hào)為2014120601；氫氧化鈉片由成都市科龍化工試劑廠(chǎng)生產(chǎn)；戊巴比妥鈉由merck公司生產(chǎn)，批號(hào)為908M034；阿拉伯膠由天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所生產(chǎn)，批號(hào)為204-2000；動(dòng)物型超純水機(jī)由摩爾公司生產(chǎn)；PHSJ-3F型pH筆由上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；pH精密試紙（5.5-9.0）由杭州富陽(yáng)特產(chǎn)紙業(yè)有限公司生產(chǎn)；電熱水恒溫杯由墊中墊公司生產(chǎn)，貨號(hào)QC2016030801。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組 先將98只SD大鼠隨機(jī)分為3組，其中50只用NaOH溶液配制法、24只用NaHCO3溶液配制法和24只用改良法進(jìn)行失眠大鼠造模，造模成功后再將SD雄性大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組：空白組、模型A組（PCPA 0.3 g/kg）、模型B組（PCPA 0.4 g/kg）、模型C組（PCPA 0.5 g/kg）進(jìn)行失眠模型評(píng)價(jià)。

1.2.2 NaOH溶液配制弱堿性生理鹽水溶解PCPA法[2] 將NaOH片劑溶于水，配成5%NaOH溶液，在0.9%NaCl溶液中緩慢滴入NaOH溶液，用pH筆調(diào)節(jié)至pH 7～8之間，加入PCPA，攪拌后用超聲機(jī)超聲15 min后，進(jìn)行腹腔注射，連續(xù)注射2 d；空白組腹腔注射同體積的生理鹽水。

1.2.3 NaHCO3溶液配制弱堿性生理鹽水溶解PCPA法[3] 將NaHCO3片劑溶于水，配成5% NaHCO3水溶液，在0.9%NaCl溶液中緩慢滴入NaHCO3水溶液，用PH筆調(diào)節(jié)至PH 7-8之間，加入PCPA，攪拌后用超聲機(jī)超聲15 min后，進(jìn)行腹腔注射，連續(xù)注射2 d；空白組腹腔注射同體積的生理鹽水。

1.2.4 PCPA混懸液配制的改良法 通過(guò)分析前2種方法的不足而探索出來(lái)的方法。用電熱水恒溫杯配置30～40 °C的溫水，將 NaHCO3片劑溶于溫水，配成5% NaHCO3水溶液，在0.9%NaCl溶液中緩慢滴入NaHCO3水溶液，用pH精密試紙測(cè)試，根據(jù)pH精密試紙變色值調(diào)節(jié)滴入的NaHCO3溶液量，直至pH 7～8之間，加入PCPA，攪拌后加入10%阿拉伯膠，用超聲機(jī)超聲15 min后，制成弱堿性生理鹽水，按1 mL/100 g進(jìn)行腹腔注射，連續(xù)注射2 d；空白組腹腔注射同體積的生理鹽水。

1.2.5 模型成功的判定[4] 首次注射后36 h觀(guān)察模型組大鼠晝夜節(jié)律消失，日間與夜晚皆活動(dòng)不斷，結(jié)合采用經(jīng)典的戊巴比妥鈉翻正實(shí)驗(yàn)進(jìn)行失眠模型評(píng)價(jià)，戊巴比妥鈉劑量35 mg/kg（預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)得出引起100%大鼠睡眠的最小閾劑量）按50 mg/mL溶于生理鹽水進(jìn)行腹腔注射，記錄大鼠的睡眠潛伏期及睡眠持續(xù)時(shí)間，若模型組與空白組對(duì)比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示造模成功。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料滿(mǎn)足正態(tài)性以“x±s”描述，不滿(mǎn)足正態(tài)性時(shí)以（Me，Q）描述，組間對(duì)比首先進(jìn)行正態(tài)性、方差齊性檢驗(yàn)，滿(mǎn)足正態(tài)性、方差齊性采用單因素方差分析，否則采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，假設(shè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05[5]。

2 結(jié)果

2.1 大鼠失眠模型造模方法

2.1.1 NaOH溶液配制弱堿性生理鹽水溶解PCPA法 PCPA難溶于冷水，混懸液有大量顆粒樣沉淀；NaOH堿性偏強(qiáng)，而pH筆讀數(shù)很不穩(wěn)定，依據(jù)pH筆結(jié)果持續(xù)滴入NaOH溶液，50只大鼠連續(xù)腹腔注射2 d后，45只大鼠死亡，5只精神萎靡；此外預(yù)實(shí)驗(yàn)中由于錯(cuò)誤使用藥品致死50只大鼠。

2.1.2 NaHCO3溶液配制弱堿性生理鹽水溶解PCPA法 PCPA難溶于冷水，混懸液有大量顆粒樣沉淀；pH筆讀數(shù)不穩(wěn)定，無(wú)法調(diào)節(jié)到適宜的pH 7-8之間，24只大鼠連續(xù)腹腔注射2 d后，模型組行為學(xué)沒(méi)有表現(xiàn)出晝夜節(jié)律消失，大鼠日間精神萎靡不振，睡眠潛伏期與睡眠時(shí)間比較模型組和空白組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 PCPA混懸液配制的改良法

PCPA溶于溫水后混懸液顆粒樣沉淀以及乳白色浮沫較少，24只大鼠連續(xù)腹腔注射2 d后，0.5 g/kg模型組大鼠出現(xiàn)晝夜節(jié)律消失、白天活動(dòng)不停、對(duì)外界的聲、光等刺激異常敏感，興奮性增高、攻擊性增強(qiáng)、毛硬粗糙、毛豎起無(wú)光澤，持續(xù)觀(guān)察1個(gè)周期間體質(zhì)量增加緩慢、飲食量明顯減少、飲水量明顯增多。

2.2.1 改良法造模組的戊巴比妥鈉睡眠實(shí)驗(yàn)比較 注射PCPA 36 h后，用經(jīng)典的戊巴比妥鈉翻正實(shí)驗(yàn)進(jìn)行失眠模型評(píng)價(jià)，0.5 g/kg模型組大鼠與空白組對(duì)比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示造模成功。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.2 改良法造模組的飲食量與飲水量比較 大鼠入代謝籠觀(guān)察，記錄飲食量與飲水量，模型組的飲食量低于空白組，飲水量高于空白組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.3 改良法造模組的體質(zhì)量比較 比較造模前后大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)值的變化，模型組的體質(zhì)量增長(zhǎng)量明顯低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

失眠是最常見(jiàn)的睡眠障礙，又稱(chēng)入睡和維持睡眠障礙（disorder of initiating and maintaining sleep，DIMS），患者持續(xù)長(zhǎng)時(shí)間不能獲得正常睡眠，對(duì)睡眠質(zhì)量不滿(mǎn)意，輕者入睡困難，時(shí)寐時(shí)醒，或寐而不酣，或醒后不能再寐，重則可徹夜不寐[6]，中醫(yī)學(xué)稱(chēng)之為“不寐”，是當(dāng)前社會(huì)的一種常見(jiàn)病。

為尋求治療失眠的有效方法，國(guó)內(nèi)外研究者廣泛采用PCPA失眠模型，即采用PCPA對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（如大鼠）進(jìn)行造模。PCPA是一種選擇性很高的腦內(nèi)色氨酸羥化酶的抑制劑，能阻滯腦內(nèi)5-HT的生物合成，使腦內(nèi)的5-HT的含量顯著下降，一般于造模后26～30 h可使大鼠晝夜節(jié)律消失，從而達(dá)到幾乎完全睡眠剝奪（SD）狀態(tài)，且其造模時(shí)間短、經(jīng)濟(jì)、可重復(fù)性強(qiáng)，目前對(duì)于失眠動(dòng)物模型的造模國(guó)內(nèi)外多采用此法[7-8]。如廖小英等[9]研究交泰丸對(duì)PCPA大鼠失眠模型鎮(zhèn)靜催眠的效果發(fā)現(xiàn)：5-HT合成抑制劑對(duì)氯苯丙氨酸（PCPA）可以通過(guò)消除腦內(nèi)5-HT從而達(dá)到致失眠目的，大鼠通常白晝睡眠，夜間活動(dòng)，用對(duì)氯苯丙氨酸（PCPA）注射大鼠腹腔，28～30 h后，大鼠晝夜節(jié)律消失，幾乎達(dá)到完全睡眠結(jié)果。張亞寧等[10]研究發(fā)現(xiàn)采用每天1次連續(xù)2 d腹腔注射 PCPA（300 mg/kg） 建立失眠大鼠模型，失眠大鼠自主活動(dòng)明顯增加，步態(tài)行為學(xué)出現(xiàn)異常，主要體現(xiàn)在步速、步行周期、步幅、步寬、側(cè)向移動(dòng)標(biāo)準(zhǔn)偏差等指標(biāo)上，以上檢測(cè)指標(biāo)可為評(píng)價(jià)失眠動(dòng)物模型提供依據(jù)。吳巧敏等[11]建立失眠大鼠模型時(shí)，將PCPA用生理鹽水（pH 7～8）溶解，配制成濃度為0.03 g/mL混懸液，給予大鼠腹腔注射（300 mg/kg），1次/d，連續(xù)2 d，造模后可見(jiàn)模型組大鼠出現(xiàn)晝夜節(jié)律消失，白天活動(dòng)不停，性情煩躁、攻擊性增強(qiáng)，表明造模成功。

本研究實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)在配制PCPA混懸液時(shí)，因PCPA難溶于冷水，國(guó)內(nèi)外研究主要是將PCPA弱堿性溶于生理性鹽水，主要方法是采用NaOH溶液或NaHCO3溶液配制弱堿性生理鹽水[2-3]，但大部分文獻(xiàn)鮮少提及弱堿性生理鹽水的具體配制方法。本文通過(guò)總結(jié)實(shí)驗(yàn)造模失敗的不足，認(rèn)為弱堿性生理鹽水的配制是PCPA能否有效溶解的關(guān)鍵，也是影響失眠效果的直接因素。

國(guó)內(nèi)PCPA用于失眠模型的劑量基本為0.30～0.45 g/kg，國(guó)外研究則有用至0.80 g/kg[12-15]，本文通過(guò)行為學(xué)觀(guān)察以及戊巴比妥鈉實(shí)驗(yàn)的比較，選擇了0.5 g/kg的劑量，在藥性7 d內(nèi)觀(guān)察，無(wú)大鼠死亡，證明在劑量選擇方面可以有所調(diào)整。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)改良弱堿性生理鹽水，以及選擇穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)儀器，結(jié)合戊巴比妥鈉睡眠實(shí)驗(yàn)以及飲水量、飲食量比較和體重增長(zhǎng)值的對(duì)比，判定改良法可以成功制作大鼠失眠模型。

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（本文編輯 李 杰）