王孫亞　周興　賓東華　韓忠　何清湖

〔摘要〕 目的 探討右歸丸及其拆方對(duì)腎陽(yáng)虛大鼠血清中睪酮（testosterone，T）、促黃體生成素（luteinizing hormone，LH）和皮質(zhì)醇（cortisol，CORT）的影響。方法 取3月齡SPF級(jí)雄性SD大鼠50只，隨機(jī)分成正常對(duì)照組、模型組、補(bǔ)陰藥組、補(bǔ)陽(yáng)藥組、全方組，除正常對(duì)照組外，其他組均采用后肢肌內(nèi)注射氫化可的松建立腎陽(yáng)虛動(dòng)物模型。造模成功后，補(bǔ)陰藥組、補(bǔ)陽(yáng)藥組、全方組分別給予相應(yīng)藥物連續(xù)灌胃14 d，正常對(duì)照組與模型組給予等容量的生理鹽水灌胃，停藥后第2天，經(jīng)麻醉后斷頭處死，心臟取血獲得血清，摘除雙側(cè)睪丸。記錄大鼠體質(zhì)量及睪丸質(zhì)量，并計(jì)算睪丸指數(shù)；用ELISA法測(cè)定血清中T、LH和CORT含量。結(jié)果 模型組大鼠較正常對(duì)照組大鼠體質(zhì)量、睪丸指數(shù)及血清T、LH、CORT含量均降低（P<0.05）；治療組中全方組較模型組大鼠大鼠體質(zhì)量、睪丸指數(shù)及血清T、LH、CORT含量明顯提升（P<0.05），補(bǔ)陰藥組相對(duì)補(bǔ)陽(yáng)藥組增加大鼠體質(zhì)量及血清LH含量（P<0.05），補(bǔ)陽(yáng)藥組相對(duì)補(bǔ)陰藥提升睪丸指數(shù)及血清T含量作用較強(qiáng)（P<0.05）；補(bǔ)陰組和補(bǔ)陽(yáng)組對(duì)血清CORT含量均無(wú)明顯作用（P>0.05）。結(jié)論 右歸丸全方可對(duì)腎陽(yáng)虛證大鼠體質(zhì)量、睪丸指數(shù)、血清中的T、LH和CORT表達(dá)水平產(chǎn)生良性影響，右歸丸方中的補(bǔ)陰藥在提升腎陽(yáng)虛大鼠體質(zhì)量和增加血清中LH的含量方面調(diào)控作用較好，補(bǔ)陽(yáng)藥在增加血清中T的含量和提高睪丸指數(shù)方面調(diào)控作用較好，補(bǔ)陰藥和補(bǔ)陽(yáng)藥對(duì)血清中CORT表達(dá)水平的調(diào)控均無(wú)明顯作用。

〔關(guān)鍵詞〕 右歸丸；拆方；陰中求陽(yáng)；腎陽(yáng)虛；睪酮；促黃體生成素；皮質(zhì)醇

〔中圖分類號(hào)〕R285.5 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.09.005

〔Abstract〕 Objective To explore the effect of Yougui Pill and its components on serum testosterone （T）， luteinizing hormone （LH）， and cortisol （CORT） in rats with kidney Yang deficiency. Methods A total of 50 3-month-old specific pathogen-free male Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal control group， model group， Yin nourishing component group， Yang tonifying component group， and whole prescription group. All rats except those in the normal control group were intramuscularly injected with hydrocortisone in the hind legs to establish an animal model of kidney Yang deficiency. After completion of model establishment， the rats were treated for 14 consecutive days as follows： intragastric administration of corresponding medicines for the Yin nourishing component group， the Yang tonifying component group， and the whole prescription group； intragastric administration of an equal amount of normal saline for the normal control group and the model group. On the second day of medicine discontinuation， the rats were anesthetized and decapitated； serum was collected by cardiac puncture， and both testes were also collected. Body weight and testis weight of the rats were recorded， and testicular index was calculated. ELISA was used to determine the levels of T， LH， and CORT. Results Compared with the normal control group， the model group had significantly reduced body weight， testicular index， and serum levels of T， LH， and CORT （P<0.05）. The whole prescription group had significantly increased body weight， testicular index， and serum levels of T， LH， and CORT compared with the model group （P<0.05）. Compared with the Yang tonifying component group， the Yin nourishing component group had significantly greater increases in body weight and serum LH level （P<0.05）， but significantly less increases in testicular index and serum T level （P<0.05）. Neither of the above two groups showed a significant change in serum CORT level （P>0.05）. Conclusion The whole prescription of Yougui Pill has favorable effects on body weight， testicular index， and serum levels of T， LH， and CORT in rats with kidney Yang deficiency； Yin nourishing component in the prescription reveals good effects in increasing body weight and serum LH level， and Yang tonifying component reveals good effects in increasing testicular index and serum T level； neither of the above components has an obvious effect in regulating the level of serum CORT.

〔Keywords〕 Yougui Pill； seperated prescription； reinforcing Yang from Yin； kidney Yang deficiency； testosterone； luteinizing hormone； cortisol

右歸丸來(lái)源于明代張景岳的《景岳全書》，為“陰中求陽(yáng)”治法的代表方劑，功能“益火之源，以培右腎之元陽(yáng)”，故以“右歸”為名。右歸丸是臨床上常用于治療腎陽(yáng)虛證的方藥，且療效顯著。研究證實(shí)，腎陽(yáng)虛會(huì)引起垂體下丘腦-垂體功能降低，從而使多條靶腺軸的多種因子發(fā)生變化[1-3]。垂體-靶腺軸的因子指標(biāo)是研究腎陽(yáng)虛證的金指標(biāo)，其中睪酮（testosterone，T）、促黃體生成素（luteinizing hormone，LH）和皮質(zhì)醇（cortisol，CORT）是腎陽(yáng)虛各階段共有的關(guān)鍵指標(biāo)，能準(zhǔn)確的反映腎陽(yáng)虛證垂體-靶腺軸的功能狀態(tài)[4]。本研究采用經(jīng)典氫化可的松注射液肌注2周造成大鼠腎陽(yáng)虛模型，觀察右歸丸及其拆方對(duì)腎陽(yáng)虛大鼠T、LH和CORT的表達(dá)的影響，探討右歸丸及其拆方對(duì)腎陽(yáng)虛證垂體-靶腺軸的功能調(diào)節(jié)作用?，F(xiàn)將其結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD雄性大鼠，3～4月齡，體質(zhì)量（200±20）g，50只。購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)： SCXK（湘）2013-0004，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心代購(gòu)。大鼠均自由飲水、進(jìn)食。飼養(yǎng)室溫18～22 ℃，每日更換墊料保持干燥清潔環(huán)境。光照：白天/晚上各12 h。

1.2 藥物與試劑

參照《景岳全書》原文，右歸丸全方組：熟地黃、山藥、山茱萸、枸杞子、當(dāng)歸、菟絲子、鹿角膠、杜仲、肉桂、附子[5]，各藥組成比例為8∶4∶3∶4∶3∶4∶4∶4∶2∶4。補(bǔ)陰藥組： 熟地黃、山藥、山茱萸、枸杞子、當(dāng)歸。補(bǔ)陽(yáng)藥組：菟絲子、鹿角膠、杜仲、肉桂和附子，按上述分類及用藥比例在湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診中藥房購(gòu)買，低溫冰箱保存。每7天取相應(yīng)中藥量，實(shí)驗(yàn)室潔凈水中浸泡30 min后在陶瓷中藥鍋中煎煮，首煎水量超過(guò)藥物4 cm，時(shí)間為45 min，二煎水量超過(guò)藥物2 cm，時(shí)間為30 min，將首煎和二煎藥液混合并搖勻，將其濃縮制成含生藥濃度為1 g/mL的藥液，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹6]。

氫化可的松注射液（上?，F(xiàn)代哈森藥業(yè)，規(guī)格2 mL∶10 mg/支，國(guó)藥準(zhǔn)字：H41021930）

1.3 主要儀器

Elx800型酶標(biāo)儀：北京偉科儀器有限公司；Elx50型洗板機(jī)：北京文德設(shè)備有限公司；FA1104 型電子分析天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；TC-3K電子天平，深圳市華恒科技有限公司；KD2258型輪轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)：上海仁器儀器；DT5-1型低速臺(tái)式離心機(jī)：上海仁器儀器；T ELISA試劑盒，湖南新世紀(jì)集團(tuán)，批號(hào)：ABE20723；LH ELISA試劑盒，湖南瑞智科技有限公司，批號(hào)：20160513；CORT ELISA試劑盒，湖南瑞智科技有限公司，批號(hào)：KGT003。真空采血管：上海仁器儀器。

1.4 造模與分組

氫化可的松注射液充分混勻，2.5 mg/100 g后肢肌內(nèi)注射14 d的方法造腎陽(yáng)虛模型[7]。造模完成后，收集24 h尿液，4 ℃，2 000 r/min離心5 min，取上清液，-20 ℃冰箱冷凍保存，采用ELISA法檢測(cè)尿17-OHCS含量。參考童駿峰[8]、茍小軍等[9]的方法，統(tǒng)計(jì)正常對(duì)照組10只大鼠尿17-OHCS含量為43.78 ？滋g/L，以此為切點(diǎn)值，結(jié)合大鼠的生理狀況：畏寒喜暖、四肢發(fā)涼、小便清長(zhǎng)、大便稀溏、活動(dòng)力降低、消瘦的腎陽(yáng)虛證癥狀，凡是造模后大鼠尿17-OHCS含量低于該切點(diǎn)值且具有腎陽(yáng)虛證癥狀作為造模成功依據(jù)。查隨機(jī)數(shù)字表，從50只大鼠抽取10只為正常對(duì)照組大鼠，其余大鼠造腎陽(yáng)虛證模型。依據(jù)上述指標(biāo)判斷模型建立后，40只造模大鼠全部符合納入標(biāo)準(zhǔn)，按體質(zhì)量大小查隨機(jī)數(shù)字表分為4組：右歸丸補(bǔ)陰藥組、右歸丸補(bǔ)陽(yáng)藥組、右歸丸全方組及模型組。

1.5 干預(yù)

于造模成功后的第2天開(kāi)始分別給予不同組對(duì)應(yīng)干預(yù)，連續(xù)灌胃28 d（藥量按體表面積法折算為成人用量的5倍，即灌胃量為10 g/kg）[10]。給藥對(duì)照組、模型組等容量生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃28 d。給藥后第29天，以烏拉坦（湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室中心提供）1 000 mg/kg麻醉大鼠，斷頭處死，采用心臟取血法取血清，摘除雙側(cè)睪丸進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 大鼠體質(zhì)量及睪丸指數(shù)測(cè)定 大鼠麻醉后天平稱質(zhì)量，處死后用手術(shù)剪剪開(kāi)兩側(cè)下腹部腹膜，剝離附睪組織，取出雙側(cè)睪丸并稱質(zhì)量，計(jì)算睪丸指數(shù)（睪丸指數(shù)=睪丸質(zhì)量/體質(zhì)量×100%）。

1.6.2 血清中T、LH和CORT含量的ELISA法測(cè)定 心臟取血法取血，將采血管室溫放置2 h，4 ℃離心機(jī)離心15 min（轉(zhuǎn)速1 200 r/min），采用移液器收集血清于EP管中，將EP管放入真空袋中，貼上標(biāo)簽，置于-20 ℃冰箱保存待檢；采用ELISA法，依據(jù)ELISA試劑說(shuō)明書操作，檢測(cè)血清中T、LH和CORT含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 19.0軟件處理數(shù)據(jù)。各組數(shù)據(jù)均以“x±s”表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較方差齊者采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊者采用Dunnetts法進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 右歸丸及其拆方組對(duì)腎陽(yáng)虛大鼠體質(zhì)量及睪丸指數(shù)的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量和睪丸指數(shù)均降低（P<0.05）。干預(yù)后，與模型組比較，各治療組大鼠體質(zhì)量均有提升（P<0.05），其中，全方組效果最為明顯，接近于正常對(duì)照組（P>0.05），補(bǔ)陰組與補(bǔ)陽(yáng)組比較，補(bǔ)陰組更為明顯（P<0.05）。干預(yù)后，與模型組比較，各治療組大鼠睪丸指數(shù)均有提升（P<0.05），其中，全方組提升顯著，高于正常對(duì)照組（P<0.05）；補(bǔ)陰組與補(bǔ)陽(yáng)組比較，補(bǔ)陽(yáng)組睪丸指數(shù)提升更為明顯（P<0.05）。各組間左側(cè)睪丸指數(shù)與右側(cè)睪丸指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 右歸丸及其拆方組對(duì)腎陽(yáng)虛大鼠血清中T、LH和CORT含量的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組血清中T、LH和CORT含量均減少（P<0.05）。與模型組比較，各用藥組血清T濃度均有提升（P<0.05），其中，全方組效果最好，補(bǔ)陰組與補(bǔ)陽(yáng)組比較，補(bǔ)陽(yáng)組優(yōu)于補(bǔ)陰組（P<0.05）。與模型組比較，各用藥組血清LH含量均有提升（P<0.05），其中，補(bǔ)陰組效果最好，全方組次之，補(bǔ)陰組與補(bǔ)陽(yáng)組比較，補(bǔ)陰藥優(yōu)于補(bǔ)陽(yáng)組（P<0.05）。與模型組比較，補(bǔ)陰藥組與補(bǔ)陽(yáng)藥組均對(duì)提升CORT水平無(wú)明顯效果（P>0.05），全方組雖能提升CORT水平，仍低于正常對(duì)照組水平（P<0.05）。

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎為先天之本，以其能藏先天之精，主生殖，為人體生命之本源。腎精化腎氣，腎氣分陰陽(yáng)，腎之陰陽(yáng)互根互資，協(xié)調(diào)全身五臟六腑之陰陽(yáng)，故為一身陰陽(yáng)之本。腎陽(yáng)為一身陽(yáng)氣之本，五臟之陽(yáng)氣非此不能發(fā)。但人體由于先天稟賦不足，年老體弱，過(guò)度損耗，后天失養(yǎng)等因素造成腎陽(yáng)虧虛，其溫煦、推動(dòng)等功能減退，臟腑機(jī)能衰弱，導(dǎo)致人體新陳代謝減緩，機(jī)體產(chǎn)熱不足，出現(xiàn)面色蒼白、形寒肢冷、腰膝酸痛、小便不利、舌淡苔白、脈沉細(xì)等癥狀。腎陽(yáng)虛證與諸多疾病聯(lián)系緊密，涉及全身臟腑組織，尤其以人體下丘腦-垂體-靶腺軸最為密切。

研究表明，腎陽(yáng)虛證與神經(jīng)內(nèi)分泌功能改變密切相關(guān)[11-12]，是機(jī)體多系統(tǒng)器官功能改變的綜合表現(xiàn)。下丘腦-垂體-靶腺軸是人體神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的樞紐，具備維護(hù)人體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、反應(yīng)外界刺激以及提高機(jī)體對(duì)環(huán)境適應(yīng)力等功用。下丘腦-垂體-靶腺軸的功能障礙和功能低下是腎陽(yáng)虛證的基礎(chǔ)[13-14]，腎陽(yáng)虛會(huì)引起下丘腦-垂體-靶腺不同環(huán)節(jié)、不同程度的功能紊亂[15]，反映這幾個(gè)軸功能改變的指標(biāo)是腎陽(yáng)虛證較為特異的指標(biāo)[16]。研究證明T、LH和CORT在腎陽(yáng)虛的不同階段的都可作為關(guān)鍵指標(biāo)，選用T、LH和CORT作為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，以盡量避免因環(huán)境、個(gè)體因素造成的腎陽(yáng)虛階段差異對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響[17]。

“陰中求陽(yáng)”理論是張仲景依據(jù)其對(duì)命門學(xué)說(shuō)的認(rèn)知上所提出，認(rèn)為命門水火（腎陰腎陽(yáng)）宜補(bǔ)不宜瀉。并在此基礎(chǔ)上提出了“善補(bǔ)陽(yáng)者必于陰中求陽(yáng)，則陽(yáng)得陰助而生化無(wú)窮；善補(bǔ)陰者必于陽(yáng)中求陰，則陰得陽(yáng)升而化源不竭”命門水火的調(diào)補(bǔ)原則，并創(chuàng)制了左歸丸及右歸丸[18]。右歸丸方中以大量滋陰藥物配以少量補(bǔ)陽(yáng)藥物，切合陰中求陽(yáng)之意，使陽(yáng)得陰助，生化無(wú)窮。

既往對(duì)右歸丸的研究多集中于右歸丸全方，而對(duì)右歸丸拆方研究很少。本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典的氫化可的松法復(fù)制“腎陽(yáng)虛”證動(dòng)物模型，造模結(jié)束后，檢測(cè)尿17-OHCS表達(dá)水平，造模組尿17-OHCS表達(dá)水平明顯降低（P<0.05），造模方法可靠。通過(guò)分析腎陽(yáng)虛證關(guān)鍵指標(biāo)T、LH和CORT的表達(dá)水平差異，觀察右歸丸及其拆方對(duì)腎陽(yáng)虛大鼠的不同影響。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，腎陽(yáng)虛造模大鼠生長(zhǎng)速度緩慢，睪丸指數(shù)降低，血清中T、LH和CORT表達(dá)減少。治療后右歸丸方中的補(bǔ)陰藥在提升腎陽(yáng)虛大鼠體質(zhì)量和增加血清中LH的含量方面調(diào)控作用較好，補(bǔ)陽(yáng)藥在增加血清中T的含量和提高睪丸指數(shù)方面調(diào)控作用較好，補(bǔ)陰藥和補(bǔ)陽(yáng)藥對(duì)血清中CORT表達(dá)水平的調(diào)控均無(wú)明顯作用。而右歸丸全方可使各項(xiàng)指標(biāo)趨向正常，且效果相對(duì)單一補(bǔ)陰或補(bǔ)陽(yáng)更好，說(shuō)明運(yùn)用“陰中求陽(yáng)”理論可更為有效地改善腎陽(yáng)虛證。

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（本文編輯 楊 瑛）