趙群菊　田珺　郭時印　蔣俊和

〔摘要〕 目的 研究清霾飲對大氣細顆粒物PM2.5所致大鼠肺損傷的防治作用。方法 將健康成年SD大鼠50只隨機分為空白組、PM2.5染毒組、清霾飲低劑量干預組、清霾飲中劑量干預組、清霾飲高劑量干預組。采集空氣中細顆粒物制成染毒造模所需濃度為37.5 mg/mL的顆粒物混懸液處理大鼠建立肺損傷模型，并給予不同劑量清霾飲進行干預。最后一次染毒48 h后，收集腹主動脈血及右側(cè)肺組織支氣管肺泡灌洗液，測定血清中酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）、乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathion peroxidase，GSH-Px）活性和支氣管肺泡灌洗液（BALF）中ACP、LDH活性，并觀察左側(cè)肺組織病理學改變。結(jié)果 與空白組相比，PM2.5染毒組BALF及血清中ACP、LDH的活性均明顯升高；血清中GSH-Px活性降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與PM2.5染毒組相比，清霾飲低劑量干預組各測定指標差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；而清霾飲中、高劑量干預組大鼠BALF及血清中ACP、LDH活性明顯降低；血清中GSH-Px活性升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論 清霾飲能拮抗PM2.5對肺組織所產(chǎn)生的炎性及氧化損傷，對肺組織有保護作用。

〔關鍵詞〕 細顆粒物（PM2.5）；清霾飲；支氣管肺泡灌洗液；肺損傷

〔中圖分類號〕R285.5；R256.1 〔文獻標志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.09.006

〔Abstract〕 Objective To investigate the significance of Qingmai Decoction in the prevention and treatment of fine particulate matter （PM2.5）-induced pulmonary impairment in rats. Methods Fifty healthy adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into blank group， PM2.5 exposure group， low-dose Qingmai Decoction group， medium-dose Qingmai Decoction group， and high-dose Qingmai Decoction group. Fine particles in the air were collected and made into a liquid suspension with a concentration of 37.5 mg/ml， which was used to treat rats to establish a model of pulmonary impairment. Rats were given different doses of Qingmai Decoction for intervention. At 48 hours after the last exposure， abdominal aortic blood and bronchoalveolar lavage fluid （BALF） of the right lung were collected to determine the activity of acid phosphatase （ACP） and lactic dehydrogenase （LDH） in serum and BALF as well as the activity of glutathione peroxidase （GSH-Px） in serum. Pathological section of the right lung lobe was evaluated. Results Compared with the blank group， the PM2.5 exposure group had significantly higher activity of ACP and LDH in BALF and serum and significantly lower activity of GSH-Px in serum （P<0.01）. There were no significant differences in any indices between the PM2.5 exposure group and low-dose Qingmai Decoction group （P>0.05）. Compared with the PM2.5 exposure group， the medium- and high-dose Qingmai Decoction groups had significantly lower activity of ACP and LDH in BALF and serum and significantly higher activity of GSH-Px in serum （P<0.05）. Conclusion Qingmai Decoction can protect the lung tissue by antagonizing the PM2.5-induced inflammatory and oxidative damages.

〔Keywords〕 fine particulate matter（PM2.5）； Qingmai Decoction； bronchoalveolar lavage fluid； pulmonary impairment

隨著我國工業(yè)化和城市化進程的迅猛發(fā)展，緊隨其后的持續(xù)霧霾天氣引起了人們的廣泛關注，霧霾不僅影響著氣候、環(huán)境、經(jīng)濟及社會的發(fā)展，更嚴重地威脅到人類的健康。霧霾對人體最大的危害是呼吸系統(tǒng)的損傷[1]。霧霾主要的致病因子是大氣中的細顆粒物（多為PM2.5），其進入肺組織后，引起機體炎性介質(zhì)的過度釋放與聚集導致局部發(fā)生氧化應激和炎癥反應，損傷呼吸道黏膜上皮細胞，引起氣道炎癥，而部分細顆粒物可沉積在肺泡或肺間質(zhì)內(nèi)，影響巨噬細胞功能，引起肺部炎性損傷[2-4]。清霾飲方源于漢代張仲景的“桔梗湯”，《傷寒論》311條載：“少陰病，二三日，咽痛者，可與甘草湯。不瘥者，與桔梗湯”，后世名甘桔湯，全方具有宣肺止咳，利咽解毒，祛痰排膿之功，是治療咽喉痛的基本方。前期研究發(fā)現(xiàn)桔梗[5]、甘草[6]具有抗炎作用，清霾飲在此基礎上加用了具有清熱解毒作用的野菊花[7]、山銀花[8]及具有抗氧化作用的荷葉[9]、魚腥草[10]、紅景天[11]，以上諸藥配伍有助于防治肺部炎性損傷。本研究采用細顆粒物PM2.5染毒處理大鼠建立肺損傷模型，給予不同劑量清霾飲進行干預，探討清霾飲對大氣PM2.5致肺損傷大鼠的干預作用及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

嶗應2020型空氣采樣器、玻璃纖維濾膜（青島嶗山應用技術研究所）；MK3酶標儀（Thermo公司）；H1850型臺式高速離心機（湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司）。酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）試劑盒（批號：20170310），乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，

LDH）試劑盒（批號：20170310），谷胱甘肽過氧化物酶（glutathion peroxidase，GSH-Px）試劑盒（批號：20170310），酶標板，均購于南京建成生物工程研究所。

1.2 PM2.5采集與混懸液制備

于2016年11-12月對湖南農(nóng)業(yè)大學前草坪及長沙縣規(guī)范化養(yǎng)殖場幾個污染程度不同的采樣點，用嶗應2020型空氣采樣器（電子流量計）采集大氣PM2.5細顆粒物于玻璃纖維濾膜上，24 h不間斷采樣，連續(xù)采樣1個月。將吸附有PM2.5的濾膜剪短對折浸入超純水中，低溫超聲震蕩30 min，共3次，洗脫PM2.5。用6層紗布過濾洗脫的PM2.5，濾液用4 ℃、1 000 r/min、15 min離心3次，棄上清液，稱量后-20 ℃保存，用0.9%生理鹽水配制成濃度為37.5 mg/mL的顆粒物混懸液，4 ℃冰箱備用[12]。使用前超聲震蕩15 min，混勻混懸液并滅菌。

1.3 藥品的準備

清霾飲組方：桔梗6 g，野菊花6 g，山銀花6 g，紅景天9 g，魚腥草10 g，荷葉10 g，甘草3 g。以上飲片均購自老百姓大藥房連鎖股份有限公司，經(jīng)鑒定符合藥典規(guī)定。按中藥常規(guī)煎法進行煎煮，將以上飲片以500 mL水浸泡30 min，加熱至沸騰后，保持微沸30 min，過濾；殘渣加300 mL水，進行二次煎煮，保持微沸30 min，過濾，合并兩次的過濾藥液，將藥液濃縮至生藥量0.062 5 g/mL。

1.4 實驗動物分組與給藥方法

健康成年的SPF級SD大鼠50只，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g，由湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，許可證：SCXK（湘）2013-0005，SPF級實驗室分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度18～22 ℃，相對濕度45%～55%，12 h晝夜交替，適應性喂養(yǎng)1周。將大鼠隨機分為5組，每組10只，分別為空白組、PM2.5染毒組、清霾飲低劑量干預組、清霾飲中劑量干預組、清霾飲高劑量干預組。染毒造模：空白組大鼠用氣管滴注0.9%氯化鈉溶液（8.0 mg/kg）；染毒組及清霾飲低、中、高劑量干預組大鼠氣管滴注細顆粒物（8.0 mg/kg），均每周1次，共 4 次[11-12]。給藥干預：空白組、PM2.5染毒組用蒸餾水1.5 mg/kg灌胃；清霾飲低、中、高劑量干預組初次染毒后24 h即分別給予清霾飲按不同劑量（125、250、500 mg/kg）進行灌胃，均1次/d，給藥30 d。

1.5 標本采集與檢測

最后一次染毒48 h后，對大鼠予以10%水合氯醛（0.3 mL/kg）麻醉，待麻醉成功后，腹主動脈取血5 mL，3 000 r/min離心15 min取血清，-20 ℃冰箱保存，用于酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）、乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathion peroxidase，GSH-Px）活性的測定。結(jié)扎左側(cè)肺支氣管，該側(cè)用于肺組織病理檢查取樣，取每只大鼠左側(cè)的肺臟中葉組織，切取0.1 cm×0.1 cm×0.1 cm大小組織3塊，置于10%甲醛固定液中固定，石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片，切片行HE常規(guī)染色后由兩位不了解實驗分組情況的觀察者在光鏡下觀察肺組織病理學改變并按如下標準對肺損傷進行評分[12]：每張切片于200倍視野下計數(shù)10個隨機區(qū)域，根據(jù)水腫、炎細胞浸潤及出血情況設置分值，0分=正常，1分=輕度損傷（小于25%的肺組織出現(xiàn)損傷），2分=中度損傷（25%～50%的肺組織出現(xiàn)損傷），3分=重度損傷（50%～75%的肺組織出現(xiàn)損傷），4分=超重度損傷（大于75%的肺組織出現(xiàn)損傷），取三種不同類型損傷的平均分作為該區(qū)域的肺損傷分值。未結(jié)扎的右側(cè)肺用37 ℃預溫PBS 3.5mL灌洗肺部，反復3～4次，收集支氣管肺泡灌洗液（BALF）約5 mL，3 000 r/min離心20 min，留取上清液，分裝后-20 ℃冰箱保存，用于ACP、LDH活性的測定。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以“x±s”表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊者采用SNK-q檢驗，方差不齊者用DunnettT3檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠BALF中ACP、LDH檢測結(jié)果

與空白組相比，PM2.5染毒組大鼠BALF中ACP、LDH的活性明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；與PM2.5染毒組相比，清霾飲中、高劑量干預組大鼠BALF中ACP、LDH活性明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），但低劑量干預組與染毒組相比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠血清中ACP、LDH、GSH-Px檢測結(jié)果

與空白組相比，PM2.5染毒組大鼠血清中ACP、LDH的活性明顯升高、GSH-Px活性降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；與PM2.5染毒組相比，清霾飲中、高劑量干預組大鼠血清中ACP、LDH活性明顯降低、GSH-Px活性升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），但清霾飲低劑量干預組與染毒組相比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表2。

2.3 各組大鼠肺組織病理學觀察結(jié)果

由圖1可知，空白組（圖1A）大鼠的肺泡分布均勻，結(jié)構完整，肺泡腔和肺間質(zhì)內(nèi)可見少量的炎癥細胞浸潤。PM2.5染毒組（圖1B）大鼠肺泡間隔增寬，肺泡腔增大，部分肺泡斷裂、融合，肺泡腔和肺間質(zhì)可見有大量的炎癥細胞浸潤及少量PM2.5黑色顆粒的聚集。清霾飲低劑量干預組（圖1C）大鼠肺泡腔增大、融合，肺泡腔和間質(zhì)可見明顯的炎癥細胞浸潤，未見顆粒物沉積。清霾飲中劑量干預組（圖1D）大鼠肺泡腔結(jié)構較完整，肺泡腔炎癥細胞浸潤明顯減輕，肺間質(zhì)炎癥細胞浸潤有所改善，未見顆粒物沉積。清霾飲高劑量干預組（圖1E）大鼠大部分肺泡結(jié)構完整，部分區(qū)域的肺間質(zhì)有少量的炎癥細胞浸潤，鏡下未見黑色顆粒物。肺組織病理學評分：與空白組相比，PM2.5染毒組肺組織病理學評分升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與PM2.5染毒組相比，清霾飲中、高劑量干預組肺組織病理學評分下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），清霾飲低劑量干預組與染毒組相比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表3。

3 討論

霧霾對人類健康的危害巨大，尤其是PM2.5被公認為危害最大。PM2.5是一種肺部可吸入的毒性因子，大量研究顯示人體暴露于PM2.5中將會對機體健康產(chǎn)生嚴重的損害，能引起各種呼吸道疾病，如哮喘、肺功能下降、肺癌等，甚至導致心血管疾病及免疫系統(tǒng)崩潰等[13-14]。我國一項關于PM2.5污染與居民每日病死率關系的Meta分析證實[15]，PM2.5濃度每升高10 ？滋g/m3，我國、北美和歐洲地區(qū)居民每日死亡率分別上升0.31%、1.26%和1.65%；呼吸系統(tǒng)疾病每日死亡率上升1.00%、1.78%、1.32%。也就是說，大氣中PM2.5濃度升高大大增加了居民的發(fā)病率和死亡率。因此，明確PM2.5致肺損傷的機制，探索拮抗肺損傷物質(zhì)的研究迫在眉睫。目前，已有許多研究對PM2.5致肺損傷的機制進行了探索，多認為炎性損傷及氧化應激損傷是其中心機制[16-18]。本研究結(jié)果顯示，PM2.5氣管滴注能引起大鼠血清及BALF中ACP活性的增加；血清中GSH-Px活性降低。ACP是確定炎癥反應的重要指標；GSH-Px是一種重要的自由基清除劑，可保護機體細胞免受氧化損傷，研究結(jié)果說明PM2.5滴注能引起大鼠肺部炎性及氧化性損傷，與楊露等[16]的研究結(jié)果一致。在以往的研究中，LDH被作為反映顆粒物細胞毒性的敏感指標，當細胞膜受到損傷后其通透性增強，LDH大量逸出胞外，可提示肺通透性損傷。本研究中，滴注PM2.5后大鼠BALF及血清中LDH活性均較空白組明顯升高，提示大鼠肺通透性受到損傷。經(jīng)清霾飲干預后，結(jié)果顯示，清霾飲中、高劑量組大鼠BALF及血清中ACP活性隨干預劑量的增加而降低，提示清霾飲對PM2.5引起的肺部炎癥有一定減輕作用；而清霾飲中、高劑量組大鼠BALF及血清中LDH活性降低，說明PM2.5對細胞的毒性作用得到了抑制，細胞膜受損情況有所改善；血清中GSH-Px活性升高，說明清霾飲對PM2.5所致肺損傷有一定的減輕作用。而清霾飲低劑量組大鼠血清中ACP、LDH、GSH-Px活性及BALF中ACP、LDH活性與PM2.5染毒組無異，說明低濃度的清霾飲藥效達不到防治PM2.5所致肺損傷的作用。肺病理學檢查結(jié)果同樣顯示清霾飲中、高劑量對PM2.5氣管滴注染毒引起的肺泡間隔增厚、炎細胞浸潤及細胞水腫等病理改變有減輕作用。上述結(jié)果表明清霾飲干預對PM2.5引起的肺損傷有一定減輕作用。

隨著人們健康意識的提高及對PM2.5致機體損傷機制研究的深入，學者們開始試圖尋找合理有效的抗PM2.5損傷的物質(zhì)。清霾飲的組方為桔梗、甘草、野菊花、山銀花、紅景天、魚腥草、荷葉、甘草。本方源于漢代張仲景的“桔梗湯”，桔梗湯的原方只含桔梗、甘草兩味，臨床上治療咽喉痛諸方大多由此加味而成。桔梗味苦、辛、平，歸肺經(jīng)，具有宣肺利咽、祛痰排膿的作用；甘草味甘、平，歸心、肺、脾、胃經(jīng)，能補脾益氣、祛痰止咳、清熱解毒、緩急止痛、調(diào)和諸藥。二者配伍使用，增強了宣肺止咳、利咽解毒、祛痰排膿之功。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)桔梗湯宣肺止咳、利咽解毒、祛痰排膿的功效與抗炎、祛痰等作用有關，其主要活性成分為桔梗皂苷和甘草皂苷[19]。魚腥草味辛、微寒，歸肺經(jīng)，具有清熱解毒、消癰排膿的之功，為臣。有研究發(fā)現(xiàn)鮮魚腥草揮發(fā)油可抑制脂多糖（LPS）誘導的慢性肺損傷大鼠模型肺組織中白介素-8（IL-8）、丙二醛（MDA）的產(chǎn)生， 從而發(fā)揮其抗炎、抗氧化作用[20]。紅景天味甘、苦、平，歸肺，心經(jīng)，具有益氣平喘、活血通脈的作用為佐。龔曉武等[21]對紅景天黃酮抗氧化能力的研究發(fā)現(xiàn)當紅景天黃酮濃度為0.2 mg/mL時， 對羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基的清除作用均高于50%， 且隨濃度的增高其清除自由基作用增強，這表明紅景天黃酮具有良好的抗氧化活性作用。野菊花和山銀花同屬于清熱類中藥，性寒、味苦，均具有清熱解毒的功效，其黃酮類成分是目前國內(nèi)外公認的抗氧化活性成分之一， 具有廣譜抗菌、抗病毒、抗炎、解熱等抗氧化保護作用[22-23]。荷葉性平， 味苦， 歸肝、脾、胃經(jīng)， 具有清暑化濕、涼血止血等功效為本方的佐助藥。有實驗研究發(fā)現(xiàn)荷葉黃酮具有顯著的自由基清除活性，是重要的抗氧化活性物質(zhì)[9]。

綜上所述，清霾飲能減輕PM2.5所致大鼠肺損傷，其保護機制可能與減輕肺部炎癥反應及氧化應激反應有關，這為防治大氣PM2.5致肺損傷提供了新的思路與方法。

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（本文編輯 李 杰）