景萬(wàn)星，張華山，魏 萍，徐 歡，肖啟榮，姚繼承，3*

（1.武漢佳成生物制品有限公司，湖北 武漢 430000；2.湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院,湖北 武漢 430000；3.湖北省食品發(fā)酵技術(shù)工程中心，湖北 武漢 430000）

紅曲是我國(guó)先民的一項(xiàng)偉大發(fā)明，在我國(guó)和世界微生物學(xué)開(kāi)發(fā)與利用發(fā)展史上具有極其重要的意義，是祖國(guó)寶貴的科學(xué)文化遺產(chǎn)[1]。在我國(guó)及東亞地區(qū)一直被用作食品添加劑或調(diào)味料，同時(shí)還具有防腐功能，已有上千年的發(fā)展歷史[2-3]。紅曲米具有多種生物學(xué)和藥理學(xué)作用，如抗氧化、抗血脂、抗糖尿病、抗炎、抗阿爾茨海默病、抗高膽固醇、抗高血壓、抗肥胖以及抗癌等[4-9]。部分紅曲霉菌株會(huì)產(chǎn)生橘霉素，對(duì)人體和動(dòng)物有毒害作用，橘霉素具有抗菌性、腎臟毒性、細(xì)胞毒性、遺傳毒性、免疫毒性，可以引起突變或致畸[10-15]。

REHAB M等[16]通過(guò)分離篩選，獲得紅曲霉菌M-92，經(jīng)培養(yǎng)后，獲得的紅曲米色價(jià)達(dá)到2 138 U/g，同時(shí)對(duì)多種細(xì)菌和植物病原真菌有抑制作用。劉宏等[17]通過(guò)紅光的照射能促進(jìn)紫色紅曲霉菌M9的生長(zhǎng)，提高了紅色素和黃色素的產(chǎn)量，降低了橙色素和橘霉素的產(chǎn)量。楊歡歡[18]采用紫外-氯化鋰復(fù)合誘變得到突變菌株M-H4-3，其Monaclin K產(chǎn)量可達(dá)5.33 mg/g，是原始菌株的2倍多。鄭春明等[19]通過(guò)正交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，最佳的250 mL搖瓶培養(yǎng)條件為加水30 mL，大米浸泡24 h，121℃滅菌23 min，最后獲得的紅曲米色價(jià)為2 884 U/g。莊曉曉等[20]將N+離子束誘變后的紅曲霉菌株進(jìn)行了紫外誘變，獲得了一株優(yōu)良菌株，橘霉素產(chǎn)量下降了96.6%。

一直以來(lái)，紅曲米以作坊式的生產(chǎn)模式為主，集中化程度不高，色價(jià)水平不穩(wěn)定，橘霉素得不到有效的控制，關(guān)于紅曲霉菌固體發(fā)酵工程化生產(chǎn)的研究也鮮有報(bào)道，工業(yè)化生產(chǎn)安全高效的紅曲米是本行業(yè)亟需解決的問(wèn)題。本研究希望通過(guò)淺盤試驗(yàn)、中試試驗(yàn)和工程化生產(chǎn)試驗(yàn)形成安全高效紅曲米工程化的生產(chǎn)工藝，為紅曲色素產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展提供可借鑒的經(jīng)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅色紅曲霉（Monascus anka）JC-SM12（CCTCCNO：M2014420）：武漢佳成生物制品有限公司自有菌株；大米：益海嘉里（武漢）糧油工業(yè)有限公司；橘霉素標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%）：美國(guó)Sigma公司；葡萄糖、硝酸鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、乙醇（體積分?jǐn)?shù)95%）、甲苯、乙酸乙酯、磷酸、甲醇、乙腈、碳酸鈉：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。以上試劑除甲醇和乙腈為色譜純外，其余均為分析純。

試管斜面固體培養(yǎng)基：葡萄糖6%，蛋白胨2%，瓊脂3%，pH自然。搖瓶和發(fā)酵罐種子液培養(yǎng)基：可溶性淀粉3%，硝酸鈉0.2%，磷酸二氫鉀0.15%，硫酸鎂0.1%，pH5.5～6.0。固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：早秈稻大米室溫條件下浸泡4 h，淋清、瀝干水分后放于蒸籠中蒸30 min。以上幾種培養(yǎng)基滅菌條件為：121℃，30 min。

搖瓶種子液制備方法：選取本公司已經(jīng)優(yōu)化選育的低產(chǎn)橘霉素高產(chǎn)色素的紅色紅曲霉菌株MonascusankaJC-SM12菌株制作試管斜面種子，30℃培養(yǎng)8～10 d。取500 mL搖瓶（裝液量200 mL）制作搖瓶液體種子液，接種量為1～2 cm2的斜面種子中的菌苔，30℃、180 r/min培養(yǎng)48 h。

1.2 儀器與設(shè)備

HPLC-16高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀（配RF-20A熒光檢測(cè)器、島津C18柱（250 mm×4.6 mm，4.5 μm））：日本島津公司；V-1100可見(jiàn)光分光光度計(jì)：上海美普達(dá)儀器有限公司；YL-060S超聲波清洗機(jī)：深圳市語(yǔ)路清洗設(shè)備有限公司；3 t液體發(fā)酵罐：無(wú)錫市金賽普生物化學(xué)裝備廠；不銹鋼淺盤（400 mm×300 mm×70 mm）：市售；紅曲霉發(fā)酵曲池、蒸米車、米飯攤涼機(jī)、接種機(jī)：自行設(shè)計(jì)全不銹鋼設(shè)備。

1.3 方法

1.3.1 固態(tài)培養(yǎng)基最佳pH的選擇

取15個(gè)不銹鋼淺盤，洗凈，烘干，分成5組，每組設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)，每盤裝入400 g（以干米計(jì)）固體發(fā)酵培養(yǎng)基，用食用醋酸和碳酸鈉把每組培養(yǎng)基的pH分別調(diào)成4.5、5.5、6.5、7.5、8.5，121 ℃滅菌30 min，在超凈工作臺(tái)內(nèi)，趁熱打散，冷卻至35℃，接入7%液體種子，36℃高溫養(yǎng)花20 h，然后溫度降為32℃，培養(yǎng)10d，每天翻料一次。培養(yǎng)結(jié)束后，70℃烘干，測(cè)定其色價(jià)和橘霉素的含量，并用色價(jià)/橘霉含量的比值考察菌種高產(chǎn)色素和低產(chǎn)橘霉素能力的大小。

1.3.2 固態(tài)發(fā)酵最佳培養(yǎng)時(shí)間的選擇

取18個(gè)不銹鋼淺盤，洗凈，烘干，分成6組，每組設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)，每盤裝入400g（以干米計(jì)）固體發(fā)酵培養(yǎng)基，pH參考步驟1.3.1，121℃滅菌30 min，在超凈工作臺(tái)內(nèi)，趁熱打散，冷卻至35℃，接入7%液體種子，36℃高溫養(yǎng)花20h，然后，溫度降為32 ℃，每組分別培養(yǎng)5 d、6 d、7 d、8 d、9 d、10 d，每天翻料一次。培養(yǎng)結(jié)束后，70℃烘干，測(cè)定其色價(jià)和橘霉素含量。

1.3.3 紅曲米固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

影響紅曲固態(tài)培養(yǎng)的因素很多，如培養(yǎng)基裝量、接種量、養(yǎng)花溫度、培養(yǎng)溫度（即降溫后的培養(yǎng)溫度）、首次翻曲時(shí)間、加水量等。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室之前的研究結(jié)果，選取培養(yǎng)基裝量（A）、培養(yǎng)溫度（B）、接種量（C）和養(yǎng)花溫度（D）4個(gè)關(guān)鍵因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，選擇色價(jià)/橘霉素含量的比值作為考察指標(biāo)，選擇L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 紅曲米固態(tài)培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for red kojic rice solid-state fermentation conditions optimization

1.3.4 中試制種試驗(yàn)

用3t發(fā)酵罐進(jìn)行液體種子制備，發(fā)酵罐載液量70%。培養(yǎng)基121℃滅菌30 min，冷卻至32℃，接種6.0‰的搖瓶種子液，轉(zhuǎn)速300 r/min，通氣比1.0 vvm，培養(yǎng)溫度32℃，菌絲體含量達(dá)到30 g/L即可接種固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。連續(xù)進(jìn)行3批試驗(yàn)，考察制種工藝的穩(wěn)定性。

1.3.5 中試生產(chǎn)試驗(yàn)

用發(fā)酵罐制取種子液，進(jìn)行750 kg級(jí)別的固態(tài)發(fā)酵中試生產(chǎn)，設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)。大米浸泡4h，清洗、撈出、瀝干，裝入蒸米車，通蒸汽30min，倒入攤涼機(jī)，溫度降至35℃，用接種機(jī)進(jìn)行接種。高溫房?jī)?nèi)養(yǎng)花20h后，將長(zhǎng)滿紅曲霉菌的大米培養(yǎng)基轉(zhuǎn)運(yùn)到發(fā)酵池中培養(yǎng)。培養(yǎng)基pH、培養(yǎng)時(shí)間、接種量、養(yǎng)花溫度、培養(yǎng)溫度參考前述試驗(yàn)結(jié)果。培養(yǎng)過(guò)程中，用溫度傳感器控制鼓風(fēng)機(jī)，對(duì)曲池進(jìn)行恒溫控制和補(bǔ)充氧氣，通過(guò)噴淋自來(lái)水控制物料的水分，每天早晚各翻料一次。培養(yǎng)結(jié)束后，70℃烘干，檢測(cè)其色價(jià)和橘霉素含量。

1.3.6 工程化生產(chǎn)試驗(yàn)

根據(jù)中試試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合所有生產(chǎn)環(huán)節(jié)的最優(yōu)條件，進(jìn)行生產(chǎn)工藝的貫通性驗(yàn)證。同時(shí)驗(yàn)證生產(chǎn)工藝的連貫性及各部門的協(xié)作性，連續(xù)做100 kg級(jí)、400 kg級(jí)、1 200 kg級(jí)三個(gè)級(jí)別的生產(chǎn)試驗(yàn)，每個(gè)級(jí)分別做3個(gè)平行試驗(yàn)。

1.3.7 測(cè)定方法

色價(jià)的測(cè)定方法：根據(jù)GB 1886.19—2015《食品添加劑紅曲米（粉）》中方法進(jìn)行色價(jià)的檢測(cè)[21]。橘霉素的檢測(cè)方法：根據(jù)國(guó)標(biāo)GB/T 5009.222—2016《食品中桔青霉素的測(cè)定》中方案進(jìn)行橘霉素的檢測(cè)[22]。紅曲米產(chǎn)率：紅曲霉培養(yǎng)結(jié)束后，70℃烘干，稱質(zhì)量，計(jì)算成品紅曲米占初始大米質(zhì)量的比例，即紅曲米產(chǎn)率。紅曲米的控制標(biāo)準(zhǔn)：色價(jià)≥400 U/g，橘霉素≤100 μg/kg。

2 結(jié)果與分析

2.1 固態(tài)發(fā)酵最佳pH試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)培養(yǎng)10 d的紅曲米取樣、烘干，測(cè)定色素和橘霉素的含量，結(jié)果如表2所示。含量?jī)H為1.36 μg/kg，但第8 d之后，橘霉素的合成速度迅速提高，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到10d時(shí)，橘霉素的含量達(dá)到了最大值，平均值為35.51 μg/kg。由色價(jià)和橘霉素的比值來(lái)看，培養(yǎng)時(shí)間越久，比值越小，在培養(yǎng)8 d之前，比值很大，但是色價(jià)都小于4 000 U/g，不滿足控制要求，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間≥8 d時(shí)，色價(jià)都大于4 000 U/g，且在培養(yǎng)8 d時(shí)，色價(jià)和橘霉素的比值最大。因此，培養(yǎng)8 d比較合適。

表2 pH值對(duì)紅曲米色價(jià)和橘霉素的影響Table 2 Effect of pH value on color value and citrinin content ofred kojic rice

表3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)紅曲米色價(jià)和橘霉素的影響Table 3 Effects of culture time on color value and citrinin content in red kojic rice

2.3 紅曲米固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室之前的研究結(jié)果，選擇培養(yǎng)基裝量、培養(yǎng)溫度、接種量和養(yǎng)花溫度4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

從表2可知，pH 5.5時(shí)，紅曲米的色價(jià)最高，平均值達(dá)5 072 U/g，橘霉素含量的平均值為77.93 μg/kg，色價(jià)/橘霉素含量的比值為65.08。pH 7.5時(shí)，紅曲米的色價(jià)最低，平均值為3 796U/g，橘霉素含量的平均值為61.33 μg/kg，色價(jià)/橘霉素含量的比值為61.89。pH 6.5時(shí)，紅曲米的色價(jià)平均值為4 623 U/g，橘霉素的含量最低，平均值為36.28 μg/kg，色價(jià)/橘霉素含量的比值最高，平均值為127.43。可見(jiàn)pH 6.5時(shí)，紅曲米的色價(jià)高，橘霉素含量低，由色價(jià)/橘霉素含量的比值可知，在此條件下，菌種高產(chǎn)色素和低產(chǎn)橘霉素的能力最大，其安全高效的性能最佳，最能滿足安全高效的要求。因此選擇最佳培養(yǎng)基pH值為6.5。

2.2 固態(tài)發(fā)酵最佳培養(yǎng)時(shí)間試驗(yàn)結(jié)果

紅曲的色素和橘霉素合成不同步，橘霉素總是在色素合成后期快速積累，合適的發(fā)酵周期能有效地降低橘霉素的產(chǎn)生。試驗(yàn)過(guò)程中，分別對(duì)培養(yǎng)5 d、6 d、7 d、8 d、9 d、10 d的試驗(yàn)組進(jìn)行取樣和檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果如表3所示。

由表3可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，色素和橘霉素的含量逐漸上升。當(dāng)培養(yǎng)6 d時(shí)，色素的合成速度加快，到第8 d時(shí)，色素的合成速度變慢，此時(shí)，色價(jià)的平均值已經(jīng)達(dá)到4 319 U/g，滿足了控制標(biāo)準(zhǔn)（色價(jià)≥4 000 U/g），培養(yǎng)第10 d時(shí)，色價(jià)達(dá)到最大值，平均值為4 654 U/g。在培養(yǎng)第8 d之前，橘霉素的合成速度很慢，在培養(yǎng)第8 d時(shí)，橘霉素的平均

表4 紅曲米固態(tài)培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal experiments for solid-state fermentation conditions of red kojic rice optimization

由表4可知，培養(yǎng)基裝量、培養(yǎng)溫度、接種量和養(yǎng)花溫度4個(gè)因素的極差分別為22.8、37.2、22、49，養(yǎng)花溫度對(duì)紅曲米的色價(jià)/橘霉素含量的比值影響最大，其次為培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基裝量、接種量，即養(yǎng)花溫度＞培養(yǎng)溫度＞培養(yǎng)基裝量＞接種量。由k值來(lái)看，培養(yǎng)基裝量、培養(yǎng)溫度、接種量和養(yǎng)花溫度最優(yōu)水平組合為A3B1C3D2，即培養(yǎng)基裝量500 g/淺盤、培養(yǎng)溫度32℃、接種量9%和養(yǎng)花溫度40℃，在此條件下，色價(jià)/橘霉素含量最大為195.12，能獲得高色價(jià)低橘霉素的安全高效產(chǎn)品。

2.4 中試制種試驗(yàn)結(jié)果

為了滿足工程化生產(chǎn)過(guò)程對(duì)大量液體種子的需求，進(jìn)行了3 t發(fā)酵罐種子擴(kuò)培試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 液體種子擴(kuò)培試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of scale-up tests of liquid seed

由表5可知，按照此方法培養(yǎng)的種子生長(zhǎng)周期比較短，菌種的生長(zhǎng)狀態(tài)比較好，感官特征和形態(tài)特征都很好，生長(zhǎng)旺盛，菌絲比較濃，培養(yǎng)工藝穩(wěn)定，達(dá)到了理想的結(jié)果。在連續(xù)3批次試驗(yàn)中，種子液都在30 h左右達(dá)到30 g/L以上的鮮質(zhì)量，菌絲深紅色、比較豐富黏稠、氣味正常，pH 5.0～5.5，完全滿足生產(chǎn)菌種的需要。

2.5 中試生產(chǎn)試驗(yàn)結(jié)果

連續(xù)3批750 kg級(jí)別的中試試驗(yàn)結(jié)果如表6。

由表6可知，紅曲米的產(chǎn)率都達(dá)到了40%左右；色價(jià)分別為4 898 U/g、4 992 U/g、5 088 U/g；橘霉素含量分別為37 μg/kg、42 μg/kg、35 μg/kg，均低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)及國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的要求；色價(jià)、橘霉素含量和產(chǎn)率均滿足公司工程化生產(chǎn)的要求。在連續(xù)3批次中試試驗(yàn)過(guò)程中，結(jié)合中試車間的實(shí)際情況，最終形成了穩(wěn)定的中試生產(chǎn)工藝，即首先將大米浸泡4 h、清洗、瀝干，裝入蒸米車，通蒸汽30 min，倒入攤涼機(jī)，通風(fēng)攤涼，含水量控制在35%左右；當(dāng)溫度降至35℃左右時(shí)，用接種機(jī)接種9%的液體種子；然后，將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入40℃的恒溫間打堆養(yǎng)花20 h；之后，將長(zhǎng)滿紅曲霉菌的大米培養(yǎng)基轉(zhuǎn)運(yùn)到發(fā)酵池中32℃培養(yǎng)8 d，通過(guò)鼓風(fēng)機(jī)自動(dòng)控溫和補(bǔ)充氧氣。培養(yǎng)過(guò)程中，每12 h翻料一次。當(dāng)物料的濕度＜35%時(shí)，通過(guò)噴淋自來(lái)水為發(fā)酵物料補(bǔ)充水分，水分控制在35%～45%之間。收料后，在烘干池內(nèi)70℃干燥，得到紅曲米。

表6 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)中試試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results of pilot tests of solid-state fermentation

2.6 工程化生產(chǎn)試驗(yàn)結(jié)果

在工程化試驗(yàn)中，貫通了所有生產(chǎn)環(huán)節(jié)，進(jìn)一步優(yōu)化了每個(gè)環(huán)節(jié)的連貫性，從低到高、循序漸進(jìn)地進(jìn)行了100kg、400 kg及1 200 kg級(jí)別的生產(chǎn)試驗(yàn)，同時(shí)每個(gè)級(jí)別都設(shè)置了3個(gè)平行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 固態(tài)培養(yǎng)工程化生產(chǎn)試驗(yàn)結(jié)果Table 7 Results of solid-state fermentation engineering production tests

由表7可知，連續(xù)3個(gè)等級(jí)的9個(gè)試驗(yàn)中，色價(jià)都在5000U/g左右；橘霉素含量為31～42 μg/kg，低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)；產(chǎn)率都＞40%。在1 200 kg級(jí)別的試驗(yàn)中最高色價(jià)達(dá)到5 111 U/g，且橘霉素含量?jī)H35 μg/kg，達(dá)到較好的水平。整體來(lái)看，生產(chǎn)工藝比較穩(wěn)定，能夠穩(wěn)定地生產(chǎn)出符合標(biāo)準(zhǔn)的安全高效紅曲米，實(shí)現(xiàn)了高品質(zhì)紅曲米的工程化生產(chǎn)。

3 結(jié)論

在固態(tài)發(fā)酵最佳pH的試驗(yàn)中，pH6.5時(shí)，紅曲米的平均色價(jià)為4 623 U/g，平均橘霉素含量為36.28 μg/kg，色價(jià)/橘霉素含量的平均比值為127.43。菌種高產(chǎn)色素和低產(chǎn)橘霉素的能力最大，其安全高效的性能最佳，最能滿足安全高效的要求。在固態(tài)發(fā)酵最佳培養(yǎng)時(shí)間試驗(yàn)中，培養(yǎng)8d時(shí)，紅曲米的平均色價(jià)為4654U/g，平均橘霉素含量?jī)H為1.36μg/kg，效果最好。在正交試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)4因素對(duì)紅曲米的色價(jià)/橘霉素含量的比值影響大小的順序?yàn)椋吼B(yǎng)花溫度＞培養(yǎng)溫度＞培養(yǎng)基裝量＞接種量，各因素的最優(yōu)水平組合為A3B1C3D2，即裝量500g/淺盤、培養(yǎng)溫度32℃、接種量9%和養(yǎng)花溫度40℃。

在中試制種試驗(yàn)中，菌種在30 h左右達(dá)到30 g/L以上的鮮質(zhì)量，菌絲深紅色、比較豐富黏稠、氣味正常，pH5.0～5.5，完全滿足生產(chǎn)菌種的需要。在中試生產(chǎn)試驗(yàn)找中，紅曲米的產(chǎn)率都達(dá)到了40%左右，色價(jià)均在5 000 U/g左右，橘霉素含量都≤42 μg/kg，并形成了穩(wěn)定的中試生產(chǎn)工藝。在工程化生產(chǎn)試驗(yàn)中，整合了生產(chǎn)的所有環(huán)節(jié)，形成了連貫的生產(chǎn)工藝，產(chǎn)出的紅曲米各項(xiàng)指標(biāo)保持了中試生產(chǎn)的水平，均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。

本研究為我國(guó)安全型高效價(jià)紅曲米的大規(guī)模工程化生產(chǎn)提供了可借鑒的經(jīng)驗(yàn)，改善了紅曲米產(chǎn)品的品質(zhì)，使紅曲米在食用色素產(chǎn)品中更具競(jìng)爭(zhēng)力，希望能推動(dòng)紅曲色素產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展。