王慧娟，孫建云，馬文杰*

（甘肅省疾病預(yù)防控制中心，甘肅 蘭州 730020）

酒精飲料（葡萄酒、白酒、黃酒等）作為傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)中的一個(gè)重要分支，在為人類提供大量消費(fèi)產(chǎn)品的同時(shí)也存在著一些潛在的危險(xiǎn)因素，其中伴隨發(fā)酵過(guò)程而產(chǎn)生的氨基甲酸乙酯正越來(lái)越多的引起人們的注意[1]。氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）是一種發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生的天然副產(chǎn)物，是一種水溶性致癌物質(zhì)，可引起肺腫瘤、淋巴癌、肝癌、皮膚癌等[2]。2007年國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)對(duì)氨基甲酸乙酯（EC）進(jìn)行了評(píng)估，將其修訂為2A類致癌物，即為可能的人類致癌物。隨著我國(guó)人均收入水平的提高和生活方式的改變，我國(guó)居民酒精飲料消費(fèi)量日趨上升，EC對(duì)人體健康風(fēng)險(xiǎn)問(wèn)題應(yīng)該引起我國(guó)公共衛(wèi)生的關(guān)注[3]。北美法規(guī)規(guī)定了不同飲料中所含氨基甲酸乙酯的數(shù)量及水平，世界各國(guó)逐漸重視了對(duì)其的研究工作。加拿大1985年設(shè)定了各類酒中的限量標(biāo)準(zhǔn)，其中佐餐葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量不得超過(guò)30 μg/L，美國(guó)食品和藥品管理局（food and drug administration，F(xiàn)DA）規(guī)定1988年以后生產(chǎn)的佐餐葡萄酒（酒精度≤14%vol）中氨基甲酸乙酯含量≤15 μg/L，日本清酒規(guī)定其含量≤100 μg/L，由于受到多方面限制，我國(guó)含酒精飲料中（包括黃酒、葡萄酒、白酒、啤酒）均尚未制定氨基甲酸乙酯限量標(biāo)準(zhǔn)[4-8]。目前，酒精飲料中氨基甲酸乙酯的檢測(cè)主要有氣相色譜質(zhì)譜（gas chromatography，GC）法和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）熒光檢測(cè)器法[9]。樣品的前處理方法有液液萃取、固液萃取、固相萃取和固相微萃取[10-11]。本研究旨在通過(guò)對(duì)2010年到2013年采集部分酒類產(chǎn)品中氨基甲酸乙酯的氣質(zhì)聯(lián)用法（gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）監(jiān)測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，對(duì)我省的酒類產(chǎn)品中氨基甲酸乙酯的本底污染狀況有了一個(gè)初步的的調(diào)查和了解，為廣大人民群眾健康飲酒提供指導(dǎo)數(shù)據(jù)，為風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，對(duì)于尋求如何科學(xué)有效的降低酒中氨基甲酸乙酯的潛在含量的控制措施，提升品質(zhì)，加強(qiáng)我省酒類產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和升級(jí)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃酒（37份）、白酒（65份）、葡萄酒（50份）樣品，共計(jì)152份：甘肅省14個(gè)地、州、市市售。

無(wú)水硫酸鈉：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；乙酸乙酯、乙醚、甲醇等（均為色譜純）：美國(guó)默克公司；氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)（D5-氨基甲酸乙酯）：美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A-5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、CLE-硅藻土固相萃相柱：美國(guó)Agilent公司；MX-F旋渦混合器：美國(guó)SCILOGEX公司；N-EVAP氮吹儀：美國(guó)Organomation公司；Visiprep SPE固相萃取儀：美國(guó)Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

稱取2.0 g樣品，加100 μL D5-氨基甲酸乙酯內(nèi)標(biāo)使用液，于旋渦混勻器上混勻，置于硅藻土固相萃取柱上，抽真空，讓樣液慢慢滲入柱中，靜置約10 min，用10 mL 5%乙酸乙酯/乙醚洗脫并收集于10 mL離心管中，洗脫液于30℃用氮?dú)猓∟2）緩緩吹干，用1 mL甲醇溶解移至樣品瓶中供GC-MS分析。

1.3.2 色譜條件

色譜柱為DB-INNOWAX彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25mm×0.25μm）；進(jìn)樣口溫度200℃，載氣流速1.0mL/min，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL；柱溫程序：初溫50 ℃、保持1 min，然后以10℃/min升至200℃。

質(zhì)譜條件：電子電離源（electronic ionization，EI）溫度230℃；電子能量70 eV；接口溫度220℃；采用選擇離子監(jiān)測(cè)（selected ion monitoring，SIM）模式；溶劑延遲：4 min。氨基甲酸乙酯特征離子：44、62、89，定量離子62：D5-氨基甲酸乙酯特征離子：44、64、76，定量離子64，內(nèi)標(biāo)法定量。

1.3.3 氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確移取0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL0.2μg/mL的氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，加100 μL 1.0 μg/mL的D5-氨基甲酸乙酯溶液，用甲醇定容至1.0 mL，得到質(zhì)量濃度分別為20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL、120 ng/mL、160 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液（含100.0 ng/mL D5-氨基甲酸乙酯），進(jìn)行儀器分析，繪制氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 方法的加標(biāo)回收率及精密度試驗(yàn)

稱取2.0 g樣品（可溶性固形物含量為30%～40%），分別添加50 μg/mL、100 μg/mL、250 μg/mL三個(gè)濃度水平的氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，以加標(biāo)回收率試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證方法的可靠性；每個(gè)水平至少測(cè)定6組樣品，以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）來(lái)驗(yàn)證方法的精密度。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

EC、D5-EC標(biāo)準(zhǔn)品總離子流色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 EC、D5-EC標(biāo)準(zhǔn)品總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of EC and D5-EC standards

由圖1可知，氨基甲酸乙酯（EC）的出峰時(shí)間為13.16min，D5-氨基甲酸乙酯（D5-EC）的出峰時(shí)間為13.09min。

按照1.3.3的方法，配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以氨基甲酸乙酯與內(nèi)標(biāo)D5-氨基甲酸乙酯濃度比（X）為橫坐標(biāo)，相對(duì)應(yīng)的峰面積比（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖2所示。

圖2 氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of ethyl carbamate

由圖2可知，EC標(biāo)準(zhǔn)品在20～160 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2=1；標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.479X+0.040 8。

2.2 方法的加標(biāo)回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果

按照1.3.4的方法進(jìn)行了加標(biāo)回收率試驗(yàn)和精密度試驗(yàn)，每個(gè)濃度水平進(jìn)行6次平行測(cè)定，結(jié)果如表1所示。

表1 氨基甲酸乙酯加標(biāo)回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 1 Results of adding standard recovery rate and precision degree of ethyl carbamate(n=6)

由表1可知，氨基甲酸乙酯在3水平上添加回收率范圍為81.5%～93.0%，平均回收率為84.55%～90.93%，符合色譜分析回收率80%～120%的要求，說(shuō)明方法適用。3個(gè)水平測(cè)定結(jié)果的RSD為1.94%～2.84%，均＜3%，說(shuō)明方法的精密度良好，能保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。當(dāng)試樣取2.0 g時(shí)，以信噪比（S/N）為3時(shí)對(duì)應(yīng)的含量作為方法的檢出限（limit of detection，LOD），將標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋進(jìn)樣，得到本方法氨基甲酸乙酯含量的檢出限為1.0 μg/kg，定量限為2.0 μg/kg。

2.3 樣品檢出情況

按照1.3.1的方法對(duì)所有樣品進(jìn)行了分析測(cè)定，不同酒類氨基甲酸乙酯檢出情況見(jiàn)表2，氨基甲酸乙酯檢出樣品的污染水平見(jiàn)表3。

表2 不同酒類氨基甲酸乙酯檢出情況Table 2 Detection of ethyl carbamate in different alcoholic drinks

表3 不同酒類氨基甲酸乙酯檢出樣品中污染水平Table 3 Contamination levels of ethyl carbamate in different alcoholic drinks

由表2、表3可知，所有樣本的總體檢出率為70%，其中黃酒37份，檢出28份，檢出率為75%，污染水平為2.99～77.59 μg/kg；白酒65份，檢出30份，檢出率46%，污染水平為8.31～203.39 μg/kg；葡萄酒50份，檢出49份，檢出率為98%，污染水平為1.92～25.81 μg/kg。三種酒類中白酒的檢出率最低，樣本檢出數(shù)據(jù)跨度最大，而且單個(gè)樣本的最高值出現(xiàn)在白酒中，為203.39μg/kg；葡萄酒的檢出率最高，但樣本檢測(cè)數(shù)據(jù)的跨度最小，單個(gè)樣本的最小值也出現(xiàn)在葡萄酒中，為1.92 μg/kg。

2.4 甘肅省酒類產(chǎn)品中氨基甲酸乙酯與全國(guó)水平對(duì)比

全國(guó)食品污染物監(jiān)測(cè)網(wǎng)新增酒類中EC監(jiān)測(cè)結(jié)果與甘肅省酒類樣品中氨基甲酸乙酯污染水平比較見(jiàn)圖3。

通過(guò)圖3對(duì)比發(fā)現(xiàn)，全國(guó)三種酒類EC的污染水平的狀況為黃酒最高（116μg/kg），白酒居中（50.0μg/kg），葡萄酒最低（20.5μg/kg）；甘肅省的平均數(shù)據(jù)為白酒最高（34.93μg/kg），黃酒居中（20.24 μg/kg），葡萄酒最低（9.88 μg/kg）。甘肅省的污染水平與全國(guó)的污染水平存在一定差異，主要表現(xiàn)為黃酒和葡萄酒的平均水平偏低，白酒的檢出率偏低。通過(guò)深入分析和總結(jié)，核對(duì)樣本信息后發(fā)現(xiàn)，造成差異的原因可能是：黃酒在甘肅省的酒類消費(fèi)比例中所占比重較小，品牌也比較單一，所采集到的樣品多為含黃酒的料酒等；葡萄酒存在同樣的情況，樣本中甜型或半甜型葡萄酒所占比重較大，干紅等發(fā)酵酒所占比例較低，所以整體數(shù)值偏低；白酒樣本的品質(zhì)較低，對(duì)部分樣本走訪調(diào)查發(fā)現(xiàn)整體價(jià)格不高，推斷其中的勾兌酒可能較多，因此檢出率偏低，從白酒的樣本信息還發(fā)現(xiàn)所檢測(cè)的白酒中氨基甲酸乙酯含量，酒精度越高，儲(chǔ)存時(shí)間越長(zhǎng)的白酒，氨基甲酸乙酯的含量也越高。本研究是依托國(guó)家化學(xué)污染物監(jiān)測(cè)網(wǎng)展開(kāi)的，采樣方式是委托市級(jí)兄弟單位進(jìn)行采樣，由于在樣品采集過(guò)程中，只對(duì)樣品采集地類型和采樣方式進(jìn)行了規(guī)定，沒(méi)有對(duì)樣品的類型進(jìn)行細(xì)致規(guī)定，使得研究結(jié)果與全國(guó)水平存在差異，只能代表甘肅部分酒類產(chǎn)品中氨基甲酸乙酯的污染狀況。

圖3 甘肅省與全國(guó)酒類氨基甲酸乙酯污染水平對(duì)比Fig.3 Comparison of contamination levels of ethyl carbamate in Gansu province and China

3 結(jié)論

用固相萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）法對(duì)酒類產(chǎn)品中的氨基甲酸乙酯進(jìn)行檢測(cè)，該方法的加標(biāo)回收率為84.55%～90.93%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）＜3%，方法的精密度和準(zhǔn)確度良好。對(duì)甘肅省152份酒類樣品樣品的測(cè)定結(jié)果顯示，EC檢出率為70%，其中白酒最高，其次為黃酒，葡萄酒最低，含量分別為34.93μg/kg、20.24μg/kg、9.88μg/kg。甘肅地處西北，經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平相對(duì)落后，消費(fèi)水平偏低，下一步結(jié)合膳食結(jié)構(gòu)的調(diào)查可以對(duì)該類污染物進(jìn)行有效的預(yù)測(cè)、預(yù)警及風(fēng)險(xiǎn)性評(píng)估，為更加全面的分析甘肅省酒類產(chǎn)品中氨基甲酸乙酯污染水平提供了基礎(chǔ)和思路。同時(shí)研究結(jié)果對(duì)于我國(guó)酒精飲料中EC的限量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，對(duì)于我國(guó)生產(chǎn)的酒精飲料的競(jìng)爭(zhēng)性及安全性[12-15]具有積極的意義。