王 瑞，許超麗，喬 丹，李 倩，張 軻，張珍珍*

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

新疆是我國(guó)第一大葡萄產(chǎn)區(qū)，其豐富的光熱資源有利于優(yōu)質(zhì)葡萄的生長(zhǎng)[1]。新疆的葡萄酒產(chǎn)業(yè)近幾年發(fā)展迅猛，目前已經(jīng)形成了伊犁河谷、天山北麓、吐哈盆地及焉耆盆地四大優(yōu)勢(shì)產(chǎn)區(qū)[2]。隨著葡萄酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展及食品安全問(wèn)題的出現(xiàn)，我國(guó)對(duì)葡萄酒中生物胺的關(guān)注也不斷提高。生物胺是氨基酸脫羧或醛類物由氨基酸轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)氨作用形成的，其廣泛存在于發(fā)酵食品中[3]。生物胺屬于葡萄酒中的不良代謝產(chǎn)物，有研究認(rèn)為它會(huì)引起頭痛、心悸等過(guò)敏性反應(yīng)，生物胺在人體細(xì)胞中會(huì)被某些酶代謝降解，但酒精和乙醛會(huì)抑制這些酶的活性，使得脫毒效率減小[4-7]。其中，組胺和酪胺被認(rèn)為是對(duì)人體危害最大的生物胺，部分國(guó)家已經(jīng)對(duì)葡萄酒中組胺含量作出了限定標(biāo)準(zhǔn)，例如：澳大利亞、瑞士限量范圍為≤10 mg/L，比利時(shí)≤5～6 mg/L，法國(guó)為≤8 mg/L[8-9]，而我國(guó)目前仍未對(duì)葡萄酒中組胺含量作出限量標(biāo)準(zhǔn)。研究認(rèn)為，葡萄酒中的生物胺主要是組胺、酪胺和腐胺，微生物還原利用以及其他的化學(xué)還原反應(yīng)均能降低生物胺的含量[10-12]。目前，生物胺的檢測(cè)方法也多種多樣，主要有生物傳感器（biosensor）、毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE）、薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）以及高效液相色譜（highperformance liquid chromatography，HPLC）法等[13-15]，其中HPLC因其檢測(cè)靈敏度高、柱效高、檢測(cè)分析速度快等原因成為葡萄酒中生物胺檢測(cè)最常用的方法之一。

本研究采用高效液相色譜法對(duì)新疆四大優(yōu)勢(shì)產(chǎn)區(qū)60個(gè)葡萄酒樣品中的生物胺總含量及8種生物胺（色胺、苯乙胺、酪胺、組胺、腐胺、尸胺、亞精胺、精胺）組分含量進(jìn)行檢測(cè)，分析比較不同品種及產(chǎn)區(qū)葡萄酒中生物胺總含量及其中8種生物胺含量的差異，對(duì)新疆葡萄酒中生物胺含量的安全控制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

新疆天山北麓、伊犁河谷、焉耆盆地和吐哈盆地四大產(chǎn)區(qū)60個(gè)葡萄酒樣品：市售。葡萄酒樣品類型及編號(hào)見(jiàn)表1。

表1 葡萄酒樣品類型及編號(hào)Table 1 Types and number of wine samples

1.1.2 試劑

丙酮、甲醇、色胺、苯乙胺、酪胺、組胺、腐胺、尸胺、亞精胺、精胺、丹磺酰氯（均為色譜純）：美國(guó)Sigma公司；氯化鈉、乙醚、氯仿、正丁醇（均為分析純）：南京化學(xué)試劑股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1200Series高效液相色譜儀：美國(guó)Agilent公司；CT-6020A酸度計(jì)：深圳市柯迪達(dá)電子有限公司；PL303電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；D2155W離心機(jī)：美國(guó)Sigma公司；HS120210漩渦儀：美國(guó)HeathrowVortexer公司；0.22 μm孔徑有機(jī)相濾膜：上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

向10mL的葡萄酒樣品中添加NaCl至飽和，待樣品飽和后，取上清液5mL于離心管中，調(diào)節(jié)pH值為12.0，加入5 mL正丁醇-氯仿溶液（正丁醇∶氯仿=1∶1，V/V）振蕩萃取5 min，在3 600 r/min的條件下離心10 min，吸取上層清液。重復(fù)萃取過(guò)程2次后，移取3mL萃取液于10mL試管中，加入0.3 mL HCl（1 mol/L），振蕩混合后，氮?dú)猓∟2）吹干，加入1 mL HCl（0.1 mol/L）溶解，樣品待衍生。

1.3.2 生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

采用HCl（0.1 mol/L）分別將8種生物胺（色胺、苯乙胺、酪胺、組胺、腐胺、尸胺、亞精胺、精胺）標(biāo)準(zhǔn)品溶解，配制成質(zhì)量濃度均為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，并保存于4℃。分別取8種生物胺的標(biāo)準(zhǔn)貯備液1 mL置于10 mL的容量瓶中，用HCl（0.1 mol/L）定容，配制成生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。最后分別移取0.10 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.50 mL、5.00 mL上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，并用HCl（0.1 mol/L）定容，配制成質(zhì)量濃度分別為1.00 mg/L、2.50 mg/L、5.00 mg/L、10.0 mg/L、15.0 mg/L、25.0 mg/L、50.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的衍生

生物胺分子本身沒(méi)有紫外或者熒光吸收，必須通過(guò)衍生化的方法來(lái)使得生物胺可以被紫外或熒光檢測(cè)器檢測(cè)到，而丹磺酰氯是近幾年較為常用的氨基酸熒光衍生試劑之一，丹磺酰氯與生物胺反應(yīng)，能夠形成具有很強(qiáng)熒光的單酞化衍生物，從而使生物胺能夠被檢測(cè)到。

標(biāo)準(zhǔn)品的衍生：取上述生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL，向其加入1 mL丹磺酰氯，1.5 mL飽和碳酸氫鈉，60℃下避光反應(yīng)30min后，再加入100μL谷氨酸鈉溶液混合均勻，60℃條件下反應(yīng)15 min。反應(yīng)結(jié)束后，各加入1 mL超純水，混勻，40℃條件下氮?dú)獯等ケＨ缓蠹尤胍颐? mL進(jìn)行萃取，并重復(fù)萃取2次，合并乙醚萃取液，40℃條件下氮?dú)獯蹈珊?，? mL色譜純甲醇進(jìn)行溶解，過(guò)0.22 μm濾膜，濾液待測(cè)。

樣品的衍生：同標(biāo)準(zhǔn)溶液的衍生方法。

1.3.4 生物胺含量的檢測(cè)

采用高效液相色譜法檢測(cè)葡萄酒中的生物胺含量。

色譜條件：流動(dòng)相A為甲醇，B為超純水，梯度洗脫，C18色譜柱（150 mm×4.6 nm，5 μm），進(jìn)樣量20 μL，柱溫30℃，流速：1.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，梯度洗脫程序見(jiàn)表2。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program

定性分析：在相同的色譜條件下，對(duì)照8種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖出峰時(shí)間，對(duì)樣品中各生物胺進(jìn)行定性分析。

定量分析：通過(guò)HPLC色譜檢測(cè)葡萄酒樣品中各生物胺的峰面積，根據(jù)8種生物胺標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計(jì)算葡萄酒樣品中各生物胺的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 新疆四大產(chǎn)區(qū)葡萄酒中生物胺總量的測(cè)定

葡萄酒樣品中各生物胺組分高效液相色譜圖如圖1所示。新疆四大產(chǎn)區(qū)葡萄酒中生物胺總含量的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖1 葡萄酒樣品不同生物胺組分檢測(cè)的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of different kinds of biogenic amines in wine samples

圖2 新疆四大產(chǎn)區(qū)葡萄酒樣品中生物胺的總含量Fig.2 Total contents of biogenic amines in wine samples from four major production areas in Xinjiang

由圖1可知，葡萄酒樣品中生物胺組分在35 min內(nèi)分離效果較好，葡萄酒樣品中各生物胺出峰時(shí)間順序?yàn)椋荷罚?.51 min）、苯乙胺（14.56 min）、腐胺（17.87min）、尸胺（20.53 min）、組胺（22.92 min）、酪胺（25.39 min）、亞精胺（27.62 min）、精胺（28.36 min）。

由圖2可知，新疆葡萄酒中生物胺含量在9.15～226.13 mg/L范圍內(nèi)波動(dòng)。新疆四大產(chǎn)區(qū)各葡萄酒中生物胺含量有所不同，其中天山北麓產(chǎn)區(qū)葡萄酒樣品中生物胺總含量在10.28～130.57 mg/L，伊犁河谷產(chǎn)區(qū)生物胺總含量在49.93～64.67 mg/L，焉耆盆地產(chǎn)區(qū)生物胺總含量在9.66～168.60 mg/L，吐哈盆地產(chǎn)區(qū)生物胺總含量在9.66～226.13 mg/L。其中，伊犁河谷產(chǎn)區(qū)的葡萄酒樣品中生物胺含量較其他三個(gè)產(chǎn)區(qū)含量相對(duì)較少，各樣品中生物胺總含量均＜64.67 mg/L，57號(hào)吐哈盆地的赤霞珠干紅含量較高，達(dá)到了226.13 mg/L。而在同一產(chǎn)區(qū)中，不同釀酒品種葡萄酒中生物胺含量也不同，如天山北麓產(chǎn)區(qū)中14號(hào)黑比諾干紅生物胺總含量為13.59 mg/L，而赤霞珠干紅最高達(dá)到172.17 mg/L。吐哈盆地產(chǎn)區(qū)酒樣雖同為赤霞珠干紅，但各樣品中生物胺含量也不相同，說(shuō)明葡萄酒中生物胺的生成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，葡萄酒釀造所選釀酒原料、輔料及葡萄酒生產(chǎn)工藝以及后期貯藏條件等都有可能對(duì)葡萄酒中生物胺含量造成一定的影響[16-17]。

2.2 新疆四大產(chǎn)區(qū)葡萄酒中生物胺組分含量測(cè)定

分別對(duì)新疆四大產(chǎn)區(qū)葡萄酒中的精胺、亞精胺、組胺、色胺、酪胺、苯乙胺、腐胺及尸胺8種生物胺的含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，除個(gè)別酒樣中酪胺和亞精胺未檢出外，其余樣品中組胺、酪胺、精胺、亞精胺、腐胺、尸胺、苯乙胺和色胺均檢出。天山北麓、伊犁河谷、焉耆盆地及吐哈盆地四大產(chǎn)區(qū)60個(gè)葡萄酒樣品中8種生物胺的含量均存在一定的差異。其中，精胺相對(duì)于其余7種生物胺含量較高，54號(hào)吐哈盆地產(chǎn)區(qū)的赤霞珠干紅含量最高，為154.60 mg/L，而40號(hào)焉耆盆地產(chǎn)區(qū)的霞多麗干白含量最低，僅為0.90mg/L；苯乙胺含量較少，在0.33～4.50 mg/L范圍內(nèi)；組胺是所有生物胺中對(duì)人體危害較大的一種[18-19]，經(jīng)檢測(cè)，各產(chǎn)區(qū)葡萄酒樣品中組胺含量均≤15.34 mg/L，其中焉耆產(chǎn)區(qū)的31號(hào)赤霞珠干紅酒樣中組胺含量最高，為15.34 mg/L，其它各葡萄酒樣品中組胺含量均在0.64～12.17 mg/L之間，60個(gè)葡萄酒樣品中的腐胺和尸胺含量相對(duì)平穩(wěn)，其余6種生物胺含量在各樣品中差異較大。同時(shí)可以看出，同一產(chǎn)區(qū)中不同品種釀造的各葡萄酒樣品中生物胺含量也有所區(qū)別，說(shuō)明生物胺含量與釀酒原料也有一定關(guān)系。而同一產(chǎn)區(qū)中的赤霞珠干紅中的生物胺含量的差異有可能與不同酒莊釀造工藝與衛(wèi)生環(huán)境有關(guān)。

圖3 新疆四大產(chǎn)區(qū)葡萄酒樣品中8種生物胺組分的含量Fig.3 Contents of eight kinds of biogenic amines components in wine samples from four major production areas in Xinjiang

3 結(jié)論

本研究采用高效液相色譜法，對(duì)新疆天山北麓、吐哈盆地、焉耆盆地及伊犁河谷四大優(yōu)勢(shì)產(chǎn)區(qū)60個(gè)酒樣中的生物胺總含量及8種生物胺含量進(jìn)行檢測(cè)分析。不同產(chǎn)區(qū)中生物胺總含量有所差異，其中天山北麓產(chǎn)區(qū)葡萄酒樣品中生物胺總含量在10.28～130.57 mg/L，焉耆盆地產(chǎn)區(qū)生物胺總含量在49.93～64.67 mg/L，吐哈盆地產(chǎn)區(qū)生物胺總含量在9.66～168.60mg/L，伊犁河谷產(chǎn)區(qū)生物胺總含量在9.66～226.13mg/L。而同一產(chǎn)區(qū)中的不同的葡萄酒樣品中生物胺含量也有所不同，如6號(hào)和9號(hào)樣品雖同為天山北麓產(chǎn)區(qū)的赤霞珠干紅，但其組胺含量相差11.44 mg/L。各產(chǎn)區(qū)葡萄酒中，精胺所占比重較大，含量在0.90～154.60 mg/L范圍內(nèi)；苯乙胺含量較低，在0.33～4.50 mg/L范圍內(nèi)；組胺含量均＜15.34 mg/L；腐胺和尸胺含量相對(duì)平穩(wěn)，其余6種生物胺含量在各樣品中差異較大。