康 超，楊玉霞，馮 珍，帥 良1，，羅楊合1，，段振華，伍淑婕*

（1.賀州學院 食品科學與工程技術研究院，廣西 賀州 542899；2.賀州學院 食品與生物工程學院，廣西 賀州 542899；3.廣西果蔬保鮮和深加工研究人才小高地，廣西 賀州 542899；4.大連工業(yè)大學 食品學院，遼寧 大連 116034）

百香果（Passiflora edulis）學名西番蓮，又稱巴西果、雞蛋果，是西番蓮科多年生木質藤本植物果實的通稱，因其香氣濃郁，可散發(fā)出菠蘿、香蕉等多種水果香味，故得名百香果[1-2]。它是世界上已知最香的水果之一，被國內外譽為“果汁之王”[3-4]。研究表明，百香果富含天然活性成分類黃酮，其是減除煩躁和緩減壓力的基本元素，能生津止渴，提神醒腦，食用后能增進食欲，促進消化腺分泌，有助消化[5-6]。果實中含有多種維生素，能降低血脂，防治動脈硬化，降低血壓，其果汁需求量在國際市場上呈供不應求的趨勢[7-9]。

果醋具有豐富的營養(yǎng)價值，富含有機酸、多種氨基酸、礦物質、維生素及生物活性物，有效維持體內的酸堿平衡，能刺激大腦神經中樞，提高人體的消化吸收，提高肝臟的解毒機能，調節(jié)血液循環(huán)系統(tǒng)，提高人體免疫力的功效[10-11]，具有抗氧化活性等功能[12-13]。按用途分類，果醋可分為調味型和飲料型果醋，調味型果醋一般酸度＞3.5%，飲料型果醋酸度＞0.3%，但≤1.5%。飲料型果醋可由調味型果醋稀釋調配而成[14-15]。

百香果鮮果具有水分含量高，不耐長久儲運等缺點，而被用于鮮食。百香果的深加工不僅能提供各種高附加值的產品，而且還能帶動整個百香果產業(yè)的發(fā)展[16]。果醋以其良好的儲藏性與靈活的使用性，深受廣大消費者的喜愛，是果蔬產品開發(fā)的主要途徑之一，主要是作為復合型果蔬飲料進行研究[17-19]，百香果果醋發(fā)酵工藝及質量等研究較少[20-23]。本研究主要采用單因素試驗考察醋酸菌接種量、溫度、初始酒精度、轉速對液態(tài)發(fā)酵百香果果醋的影響，應用析因試驗、響應面試驗優(yōu)化百香果醋發(fā)酵工藝參數，并對其質量進行分析。以期為廣西特色水果百香果的資源利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料酒

原料酒：以前期試驗最優(yōu)發(fā)酵條件下得到的百香果果酒作為發(fā)酵原料酒，酒精度為10.7%vol，可溶性物含量為5.6%。

1.1.2 菌種

巴氏醋酸菌（Acetobacter pasteurianus）AS 1.41：廣東省微生物菌種保藏中心。

1.1.3 試劑

酵母膏、葡萄糖、瓊脂粉、無水乙醇、氫氧化鈉、牛肉膏等（均為國產分析純或生化試劑）：國藥集團化學試劑公司；果膠酶（10 000 U/g）、纖維素酶（100 FBG/g）：諾維信生物技術有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖1%，酵母膏1%，CaCO31.5%，酒精2%（滅菌冷卻至50～60℃后加入），瓊脂2%。

種子液培養(yǎng)基：葡萄糖1%，酵母膏1%，酒精2%（滅菌冷卻至50～60℃后加入）。

以上培養(yǎng)基均在0.1 MPa、121℃條件下滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

ZWYR-D2403恒溫振蕩搖床：上海智誠分析儀器制造有限公司；BSA124S電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；SQ510C高壓蒸汽滅菌鍋：重慶雅馬拓科技有限公司；HWS-12電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學儀器有限公司；DHG-9145A電熱恒溫鼓風干燥箱：上海齊欣科學儀器有限公司；DL-CJ-2N超凈臺：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；UV1901PC紫外可見分光光度計：上海奧析科學儀器有限公司；BX53顯微鏡：日本奧林巴斯有限公司；Fe20-K pH計：美國METTLER TOLEDO集團公司。

1.3 方法

1.3.1 百香果果醋發(fā)酵工藝流程及操作要點

操作要點：

（1）百香果果汁的制備[24]：百香果洗凈、切開、破碎、酶解（果膠酶、纖維素酶），獲得百香果果汁。

（2）酒精發(fā)酵[25]：（已滅酶）獲得的百香果果汁為原料，接入酵母種子液進行酒精發(fā)酵，其中最優(yōu)工藝條件為酵母接種量0.05%、初始糖度21.8%、發(fā)酵時間6d、發(fā)酵溫度29℃，得到百香果果酒。

（3）醋酸發(fā)酵：以過濾后的百香果果酒為原料，調整初始酒精度為4%vol～9%vol，醋酸菌接種量4%～12%（V/V），轉速90～210 r/min，溫度26～34℃，進行醋酸發(fā)酵，獲得百香果果醋液。

（4）過濾：將百香果果醋液過濾后，得到澄清的百香果果醋溶液。

（5）調配、殺菌、灌裝。

1.3.2 百香果果醋發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

巴氏醋酸菌的活化：將保存在4℃環(huán)境下的安瓿管取出，用脫脂棉（體積分數為75%的酒精浸泡）擦拭安瓿管，將其尖端放在火焰上加熱，滴少量無菌水至加熱處使之破裂，用鑷子輕輕敲開，取出小管內的脫脂棉，將管口處在火焰上灼燒片刻，呈懸浮狀，即成菌液。吸取0.5 mL菌液劃線接種到2根斜面培養(yǎng)基，在30℃的溫度下培養(yǎng)48 h，經過2次繼代培養(yǎng)后，備用。菌種可在2～8℃環(huán)境下保存3個月。

種子液的制備：用接種環(huán)將斜面培養(yǎng)基上的巴氏醋酸菌刮入含有200 mL種子液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，四層紗布封口，置于30℃恒溫振蕩箱中培養(yǎng)48 h，檢測其巴氏醋酸菌總數，約達5.7×106CFU/mL。

單因素試驗：以巴氏醋酸菌接種量10%（V/V）、初始酒精度7%vol、發(fā)酵溫度32℃、轉速150 r/min，糖度5.6%為基本條件，以總酸含量作為評價指標，采用單因素輪換法，選取百香果果醋發(fā)酵工藝中巴氏醋酸菌接種量（4%、6%、8%、10%、12%、14%）、原料酒初始酒精度（4%vol、5%vol、6%vol、7%vol、8%vol、9%vol）、發(fā)酵溫度（26 ℃、28℃、30 ℃、32℃、34 ℃）、發(fā)酵轉速（90 r/min、120 r/min、150 r/min、180 r/min、210 r/min）進行單因素試驗，用四層紗布封口，每隔24 h測定總酸含量，考察4個因素對百香果果醋發(fā)酵的影響。

1.3.3 百香果果醋發(fā)酵工藝優(yōu)化析因試驗

析因試驗是一種科學有效試驗方法，可以對多因素多水平交叉分組進行分析檢驗顯著因子。在前期單因素試驗的基礎上，結合相關文獻報道[26-28]，本試驗設計N=16的析因試驗，以總酸含量（Y）為評價指標，考察巴氏醋酸菌接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）、轉速（C）、發(fā)酵時間（D）4個因素對百香果果醋發(fā)酵時產酸效果的影響，每個因素取2個水平：低水平用“-1”表示，高水平用“+1”表示，析因試驗設計見表1。

表1 百香果果醋發(fā)酵工藝優(yōu)化析因試驗設計Table 1 Design of the factorial experiments forPassiflora edulis vinegar fermentation technology optimization

1.3.4 百香果果醋發(fā)酵工藝優(yōu)化響應面試驗

在單因素試驗和析因試驗的基礎上，以總酸含量（Y）為評價指標，采用Box-Behnken法設計試驗，對析因試驗篩選出的顯著因子巴氏醋酸菌接種量（X1）、轉速（X2）和發(fā)酵時間（X3）進行響應面試驗，響應面試驗設計因素與水平見表2。

表2 百香果果醋發(fā)酵工藝優(yōu)化響應面試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface methodology experiments forPassiflora edulisvinegar fermentation technology optimization

1.3.5 測定方法

總酸的測定[29]：參考國標GB/T 12456—2010《食品中總酸的測定》中酸堿滴定法測定。

醋酸菌總數[30]：參考國標GB 4789.2—2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》中的平板計數法檢測。

根據國標GB/T 18187—2000《釀造食醋》標準中的檢測方法，檢測百香果醋中的不揮發(fā)酸、可溶性無鹽固形物、游離礦酸、黃曲霉毒素B1、鉛、砷、菌落總數、大腸菌群、致病菌（沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌）[31]。

1.3.6 數據分析

使用Microsoftofficeexcel2012、Origin8.5、SPSSStatistics和Design-Expert.8.05進行數據處理、圖表制作及數據分析。

2 結果與分析

2.1 百香果果醋發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗結果

2.1.1 巴氏醋酸菌接種量對百香果果醋中總酸含量的影響

不同的巴氏醋酸菌接種量對百香果醋總酸含量的影響結果見圖1。

圖1 不同巴氏醋酸菌接種量對百香果果醋總酸含量的影響Fig.1 Effects of different amounts ofA.pasteurianuson total acid contents inPassiflora edulisvinegar

由圖1可知，接種量直接影響醋酸發(fā)酵的原料轉化速率和周期，接種量過小或過大都不利于醋酸發(fā)酵的進行。接種量為4%和6%時，發(fā)酵前4 d，醋酸菌代謝產酸不明顯（約0.7 g/100 mL），第5天后才迅速產酸，分別發(fā)酵第9天和第11天后，總酸含量基本保持穩(wěn)定（3.7 g/100 mL），最終總酸含量偏低（最高值約3.9 g/100 mL），這可能是由于菌體量少，發(fā)酵不充分，產酸能力較弱；當接種量為14%時，產酸曲線呈先上升后逐漸下降的趨勢，產酸效果不理想（最高值約2.5 g/100 mL），這是因為接種量過大，菌體生長繁殖消耗過多的營養(yǎng)物質，導致代謝產酸量低，發(fā)酵后期，由于菌體老化，出現逐漸下降的趨勢；當接種量為12%時，發(fā)酵前期產酸迅速（總酸含量變化為0～4.7 g/100 mL），發(fā)酵第6天后，發(fā)酵產酸基本結束，總酸含量穩(wěn)定（4.7g/100mL）；當接種量為8%和10%時，發(fā)酵的產酸曲線趨勢相同，發(fā)酵到11d時，達到最高值，均超過5.1g/100mL。整體來看，百香果果醋發(fā)酵巴氏醋酸菌最優(yōu)接種量為8%。

2.1.2 初始酒精度對百香果果醋中總酸含量的影響

巴氏醋酸菌發(fā)酵的主要營養(yǎng)物質是酒精，酒精度越高產酸量越高，但是酒精濃度過高時會抑制醋酸菌的生長和代謝，使產酸量下降，發(fā)酵周期延長。不同初始酒精度對發(fā)酵過程中巴氏醋酸菌產酸的影響結果見圖2。

圖2 不同初始酒精度對百香果果醋中總酸含量的影響Fig.2 Effects of different initial alcohol contents on total acid contents inPassiflora edulisvinegar

由圖2可知，不同的初始酒精度，產酸量和發(fā)酵周期也不同，初始酒精度為4%vol、5%vol時，總酸含量低（僅約為2.8 g/100 mL），發(fā)酵周期短，分別發(fā)酵到5 d、7 d，產酸結束，由于酒精度偏低，醋酸菌能在短期內快速消耗酒精產酸，但是產酸量僅為2.8g/100mL；當酒精度為8%vol時，產酸曲線呈“S”型，發(fā)酵前5d，發(fā)酵緩慢，產酸量在1.0g/100mL以下，直至第9天，總酸含量不增加，最終產酸量僅為2.7g/100mL，這說明8%vol的酒精度對醋酸發(fā)酵有抑制作用；當酒精度為6%vol、7%vol時，雖然醋酸發(fā)酵周期長，但最終總酸含量明顯提高（均在4 g/100 mL以上），說明醋酸發(fā)酵較適合的初始酒精度范圍為6%vol～7%vol，為了使百香果醋得到較高的酸度，所以選取初始酒精度為7%vol。

2.1.3 發(fā)酵溫度對百香果果醋中總酸含量的影響

醋酸菌的生長溫度為25～35℃，溫度直接影響到醋酸菌的生長繁殖速度和產酸速度，適合的溫度有利于菌體生長和目的產物的生成[32-34]。不同發(fā)酵溫度對發(fā)酵過程產酸的影響結果見圖3。

圖3 不同發(fā)酵溫度對百香果果醋中總酸含量的影響Fig.3 Effects of different fermentation temperature on total acid contents inPassiflora edulisvinegar

由圖3可知，發(fā)酵前7 d，各處理組的醋酸發(fā)酵正常，產酸量相差不大（約3.5 g/100 mL），發(fā)酵7 d以后，當溫度在26～32℃范圍時，隨著溫度的提高，發(fā)酵過程中的產酸量提高（達到4 g/100 mL以上）；34℃處理組的總酸含量低于其他組別，分析原因可能是發(fā)酵后期，溫度偏高，醋酸菌提前老化，故產酸量開始逐漸降低；當發(fā)酵溫度為32℃時，發(fā)酵10d后，醋酸發(fā)酵基本結束，總酸含量較高（5.1g/100mL）；當發(fā)酵溫度為30℃時，醋酸發(fā)酵至12 d，總酸含量最高（5.2 g/100 mL）。因此，百香果果醋發(fā)酵最優(yōu)溫度為30℃。

2.1.4 轉速對百香果果醋中總酸含量的影響

醋酸菌是好氧微生物，當氧氣充足時，菌體生長代謝旺盛，缺氧會抑制發(fā)酵的進行[32-33]。不同的轉速對發(fā)酵液供氧量則不同，不同轉速對發(fā)酵過程產酸的影響結果見圖4。

圖4 不同轉速對百香果果醋中總酸含量的影響Fig.4 Effects of different rational speed on total acid contents in Passiflora edulisvinegar

由圖4可知，當轉速為180 r/min時，最終產酸量較高（5.3 g/100 mL）；當轉速為210 r/min時，發(fā)酵前5 d，其產酸量均高于其他條件，5d后，發(fā)酵產酸速率變慢，10 d后，總酸出現下降趨勢，最終總酸含量也不高（4.5 g/100 mL），分析原因可能是發(fā)酵前期由于充足的氧氣供應使得醋酸菌大量繁殖代謝，總酸迅速增加，但是發(fā)酵后期，由于乙醇和醋酸揮發(fā)或者水分的蒸發(fā)[28]，對醋酸發(fā)酵有不利的影響。綜上所述，轉速為150～180r/min，較有利于百香果發(fā)酵。

2.2 百香果果醋發(fā)酵工藝優(yōu)化析因試驗結果

固定酒精度7%vol，采用析因試驗考察巴氏醋酸菌接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）、轉速（C）、發(fā)酵時間（D）對醋酸發(fā)酵的影響，以總酸含量（Y）為評價指標，試驗結果見表3，方差分析結果見表4。

表3 百香果果醋發(fā)酵工藝優(yōu)化析因試驗結果Table 3 Results of factorial experiments forPassiflora edulisvinegar fermentation technology optimization

表4 百香果果醋發(fā)酵工藝優(yōu)化析因試驗方差分析結果Table 4 Variance analysis results of factorial experiments for Passiflora edulisvinegar fermentation technology optimization

由表4可知，發(fā)酵轉速、發(fā)酵時間對醋酸發(fā)酵影響極顯著（P＜0.01），巴氏醋酸菌接種量影響顯著（P＜0.05），發(fā)酵溫度影響不顯著（P＞0.05），因此，確定主要影響醋酸發(fā)酵的因素是轉速、發(fā)酵時間和巴氏醋桿菌接種量，并選用這3個因素進行響應面試驗，固定最優(yōu)發(fā)酵溫度為30℃，進一步確定最優(yōu)發(fā)酵條件及各因素間的交互作用。

2.3 百香果果醋發(fā)酵工藝優(yōu)化響應面試驗結果

2.3.1 模型的建立和顯著性的驗證

以總酸含量（Y）為評價指標，選取巴氏醋桿菌接種量（X1）、轉速（X2）和發(fā)酵時間（X3）3個影響顯著的因素，采用Box-Behnken對百香果醋發(fā)酵工藝條件進行響應面優(yōu)化試驗，試驗設計與結果見表5，回歸模型方差分析結果見表6。

表5 百香果果醋發(fā)酵工藝優(yōu)化響應面試驗設計與結果Table 5 Design and results of response surface experiments for Passiflora edulisvinegar fermentation technology optimization

采用Design-Expert.8.05軟件對響應面試驗結果進行多元回歸擬合分析，得到的二次回歸擬合方程：

由表6可知，該模型極顯著（P=0.000 8），模型失擬項不顯著（P=0.3812＞0.05），說明所得模擬合性較好。方程的決定系數R2為0.952 7，調整決定系數R2adj為0.891 8，信噪比為12.250，遠大于4，說明預測值與試驗值有較好的相關性，試驗誤差較小。因此可用此模型分析和預測百香果果醋的發(fā)酵工藝條件。從回歸方程模型系數的顯著性檢驗可知，模型的一次項X2、X3、交互項X2X3和二次項X22影響極顯著（P＜0.01），一次項X1、交互項X1X3及二次項X32影響顯著（P＜0.05），交互項X1X2及二次項X12影響不顯著（P＞0.05）。根據F值大小可知各因素影響醋酸發(fā)酵的主次順序為：發(fā)酵轉速（X2）＞巴氏醋酸菌接種量（X1）＞發(fā)酵時間（X3）。

表6 回歸模型方差分析Table 6 Variance analysis of regression model

2.3.2 響應面結果分析與驗證

巴氏醋酸菌接種量、轉速和發(fā)酵時間各因素兩兩交互對百香果醋發(fā)酵的影響結果如圖5所示。

圖5 接種量、轉速和發(fā)酵時間交互作用對百香果果醋總酸含量影響的響應面圖Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between inoculum,rational speed and fermentation time on total acid content inPassiflora edulisvinegar

由圖5可知，該結果與單因素試驗結果一致，隨著因素水平值的增大，總酸含量呈先逐漸增大后保持穩(wěn)定的趨勢，同時各因素的顯著性與析因試驗結果一致。由Design-Expert.8.05軟件綜合分析處理得到百香果果醋發(fā)酵工藝的最佳發(fā)酵條件為：初始酒精度7%vol、發(fā)酵溫度30℃、巴氏醋酸菌接種量11.10%、發(fā)酵轉速166.34 r/min、發(fā)酵時間10.01 d。在此優(yōu)化條件下，百香果醋中總酸含量的理論值為5.42 g/100 mL。為了檢驗模型的準確性及實用性，將工藝參數修正為：初始酒精度7%vol、發(fā)酵溫度30℃、巴氏醋酸菌接種量11%、轉速166 r/min、發(fā)酵時間10 d，在此條件下，百香果醋中總酸含量為5.37 g/100 mL，與最優(yōu)條件下的理論值（5.42 g/100 mL）接近。

2.4 百香果醋質量評價

按照國標GB/T18187—2000《釀造食醋》要求，對百香果醋的理化、衛(wèi)生指標進行檢測評定，結果如下：總酸（以乙酸計）含量為5.3g/100mL；可溶性無鹽固形物含量為2.3g/100mL；菌落總數為5 CFU/mL；大腸菌群為0 MPN/100 g；游離礦酸、砷（以As計）、鉛（以Pb計）、黃曲霉毒素B1、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、志賀氏菌均未檢出，果醋理化指標及衛(wèi)生指標均符合國家相關標準。

3 結論

本研究通過單因素試驗、析因試驗和Box-Behnken設計試驗，得出百香果果醋發(fā)酵工藝的最優(yōu)條件為：巴氏醋酸菌接種量11%、發(fā)酵溫度30℃、初始酒精度7%vol、轉速166 r/min、發(fā)酵時間10 d。在此優(yōu)化條件下，百香果果醋總酸含量為5.37 g/100 mL。經質量評價得出該百香果果醋質量符合國家標準GB/T 18187—2000《釀造食醋》要求，說明經響應面分析方法優(yōu)化獲得的工藝參數是可信的，對后期的工業(yè)化生產具有較好的參考價值。