王鳳梅，張邦建，岳泰新

（包頭輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品藥品學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014035）

單萜醇類物質(zhì)存在于絕大多數(shù)釀酒葡萄的葡萄汁中。然而，這些單萜醇類物質(zhì)以單體形式存在的量很少，絕大多數(shù)單萜醇與葡萄糖或二糖以葡萄糖苷鍵相結(jié)合，形成葡萄糖苷、6-O-α-L-呋喃阿拉伯糖基-β-D-吡喃葡萄糖苷（6-O-α-L-arabinofuranosyl-β-D-glucopyranosides）、6-O-α-L-吡喃鼠李糖基-β-D-吡喃葡萄糖苷（6-O-α-L-rhamnopyranosyl-β-D-glucopyranosides）及6-O-β-D-呋喃芹糖基-β-D-吡喃葡萄糖苷（6-O-β-D-apiofuranosyl-β-D-glucopyranosides）等芳香前體物，從而失去了其原有的香氣[1-2]。這些葡萄糖苷在加熱條件下可酸水解，然而酸水解產(chǎn)物中單萜醇的苷配基會發(fā)生重排，從而改變了其原有的香氣[3]。β-葡萄糖苷酶可水解單萜醇芳香前體物的葡萄糖苷鍵，使單萜醇芳香物得以釋放，增加葡萄酒的香氣與風(fēng)味[1]。

在一些酵母菌種中發(fā)現(xiàn)了β-葡萄糖苷酶的存在，這些酵母菌株絕大多數(shù)屬于非釀酒酵母（non-Saccharomyces），如葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、異常畢赤酵母（Pichia anomala）、淺黃隱球酵母（Cryptococcus flavescens）及星形假絲酵母（Candida stellata）等[2，4-5]，也有報(bào)道從一些野生及商業(yè)化釀酒酵母菌株中檢測到β-葡萄糖苷酶的存在[4，6]。在前期的研究工作中，也從分屬5個屬5個種的葡萄酒相關(guān)酵母菌種中分離到66株β-葡萄糖苷酶活性菌株。在葡萄酒的發(fā)酵過程中，酵母中的β-葡萄糖苷酶活性較弱，導(dǎo)致成酒中絕大多數(shù)單萜醇仍以結(jié)合的形式存在，無法賦予葡萄酒獨(dú)特的香氣與風(fēng)味[6-7]。其原因在于在葡萄汁發(fā)酵過程中，起主導(dǎo)作用的釀酒酵母與一些非釀酒酵母菌種相比，β-葡萄糖苷酶的活性相對較弱，甚至一些商業(yè)化釀酒酵母菌種中未檢測到β-葡萄糖苷酶活性的存在[4，8]；此外，酵母菌中的β-葡萄糖苷酶大多以胞內(nèi)酶的形式存在，胞壁結(jié)合及胞外酶的活性相對較弱，甚至絕大多數(shù)β-葡萄糖苷酶活性菌株無法檢測到胞外酶的存在[6，8]；發(fā)酵液中高濃度的葡萄糖、低pH值及高濃度的酒精也會抑制β-葡萄糖苷酶的活性[1-2，8]?；谶@些原因，采用釀酒酵母與非釀酒酵母混合發(fā)酵，對非釀酒酵母進(jìn)行胞壁透化處理使其胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶得以釋放，可能是解決這一問題的方法。

本研究以內(nèi)蒙古西部地區(qū)篩選到的分屬于5個屬5個種的具有β-葡萄糖苷酶活性5株酵母菌株為實(shí)驗(yàn)菌株，并對其進(jìn)行胞壁透化處理；以霞多麗葡萄汁為發(fā)酵液，采用釀酒酵母單獨(dú)發(fā)酵或與非釀酒酵母混合發(fā)酵的方式探究這些菌株中的β-葡萄糖苷酶對葡萄糖苷類芳香前體物的水解作用，為采用本土野生酵母發(fā)酵釀制具有地區(qū)特色的葡萄酒提供理論及實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 酵母菌種

酵母菌種為實(shí)驗(yàn)室冷凍保存的、分離于內(nèi)蒙古西部地區(qū)2種釀酒葡萄（霞多麗及品麗珠）漿果表面分屬5個屬5個種（釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、淺黃隱球酵母（Cryptococcus flavescens）、異常畢赤酵母（Pichia anomala）及星形假絲酵母（Candida stellata））的5株具有β-葡萄糖苷酶活性菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）培養(yǎng)基：10 g/L酵母膏，20 g/L蛋白胨，20 g/L葡萄糖，pH5.0。115℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

MJ-250B型霉菌培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠；5430臺式高速離心機(jī)：德國艾本德公司；NanoDrop 2000分光光度計(jì)：美國賽默飛世爾科技有限公司；FE 20 pH計(jì)：瑞士梅特勒-托利多國際貿(mào)易有限公司；葡萄糖苷檢測試劑盒：上海西寶生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化及擴(kuò)大培養(yǎng)

上述冷凍保藏的5個酵母菌株分別接種于YPD液體培養(yǎng)基中，于28℃條件下培養(yǎng)48 h。隨后按5%（V/V）接種量將活化后的菌株接種于含100 mL YPD液體培養(yǎng)基的三角瓶中，于28℃、72 r/min搖床培養(yǎng)24 h，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 酵母細(xì)胞透化處理

酵母細(xì)胞透化處理參照ROSI I等[5-6]報(bào)道的方法，略加改動。取5mL上述酵母培養(yǎng)液，離心（5000×g、10min、4℃），細(xì)胞沉淀經(jīng)冰冷的超純水洗滌后，采用1 mL 75 mmol/L咪唑緩沖液（pH7.5）重懸細(xì)胞，迅速向細(xì)胞懸液中加入透化液（50 μL 0.3 mmol/L還原型谷胱甘肽，10 μL 10%Triton X-100及50 μL甲苯/乙醇（1/4，V/V）混合液），劇烈振蕩5 min后，離心收集細(xì)胞，經(jīng)冰冷的超純水洗滌2次后，細(xì)胞重懸于3 mL冰冷的檸檬酸鹽-緩沖液（100 mmol/L，pH5.0）中，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

另取5 mL酵母培養(yǎng)液，離心沉淀酵母細(xì)胞，經(jīng)冰冷的超純水洗滌3次后，采用3 mL冰冷的檸檬酸緩沖液（100 mmol/L，pH5.0）重懸細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

對透化及未透化處理的酵母細(xì)胞采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板確定酵母細(xì)胞的濃度。

1.3.3 乙醇脫氫酶活性檢測

為了檢驗(yàn)酵母細(xì)胞的透化效果，需對透化處理后的酵母細(xì)胞進(jìn)行乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）活性檢測，具體方法參照BISOTTO A等[6]報(bào)道的方法。

配制含0.2mol/L甘氨酸及1.2mmol/L乙醇的溶液，采用NaOH調(diào)整pH值至8.1。隨后向其中加入等體積的0.6mmol/L NAD+溶液，混合均勻。取1mL上述溶液，向其中加入200μL透化后的酵母細(xì)胞懸液，于25℃條件下水浴5 min。隨后，采用分光光度計(jì)檢測溶液在波長340 nm處的吸光度值（OD340nm），每10 s記錄一次OD340nm值，連續(xù)記錄5 min。以O(shè)D340nm值對時間作圖，取反應(yīng)的最初線性部分，計(jì)算1 min內(nèi)OD340nm值的增加值。NADH在波長340 nm處的摩爾消光系數(shù)為6.22×103L/（mol·cm），據(jù)此計(jì)算1 min內(nèi)NADH的生成量。ADH的酶活單位（U）定義為每108個細(xì)胞1 min生成1 nmol NADH所具有的活性。

1.3.4 葡萄汁發(fā)酵液制備及發(fā)酵條件

采集成熟霞多麗葡萄，經(jīng)壓榨、攪拌后，8 000×g離心5 min后，上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾除菌后，用于后續(xù)發(fā)酵反應(yīng)。

發(fā)酵在250 mL密閉錐形瓶中進(jìn)行，150 mL葡萄汁按105個細(xì)胞/mL葡萄汁接種透化或未透化處理的酵母細(xì)胞。釀酒酵母單獨(dú)接種或與非釀酒酵母混合接種（接種細(xì)胞數(shù)量比1∶1）后，于28℃條件下靜置發(fā)酵7 d。

1.3.5 酵母菌株發(fā)酵能力檢測

于發(fā)酵7 d后檢測發(fā)酵液中酵母細(xì)胞的數(shù)量、總生物量、發(fā)酵液pH值、總CO2生成量、酒精濃度及殘?zhí)橇康葏?shù)，確定不同組合酵母菌株的發(fā)酵能力。

酵母細(xì)胞數(shù)量采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，發(fā)酵液pH值及酒精濃度分別采用pH計(jì)及酒精計(jì)進(jìn)行檢測，殘?zhí)橇坎捎觅M(fèi)林試劑直接滴定法。發(fā)酵過程中，每隔24 h，搖動瓶子，以驅(qū)除CO2，稱質(zhì)量，確定CO2生成量，連續(xù)統(tǒng)計(jì)7 d，確定總CO2生成量。

取50 mL發(fā)酵液懸液，經(jīng)預(yù)先稱質(zhì)量的0.45 μm濾膜過濾，酵母細(xì)胞經(jīng)超純水洗滌2次后，于105℃烘箱中過夜，待其徹底干燥后稱質(zhì)量，確定發(fā)酵液中的總生物量。

1.3.6 發(fā)酵液中葡萄糖苷類物質(zhì)濃度檢測

發(fā)酵液中剩余的葡萄糖苷能夠反映發(fā)酵過程中酵母細(xì)胞β-葡萄糖苷酶的活性。葡萄糖苷的測定方法參照WILLIAMS P J等[9]報(bào)道的方法。

于發(fā)酵結(jié)束后，取3 mL發(fā)酵液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，采用C18烷基Bakerbond SPE（Solid Phase Extraction）小柱對濾液進(jìn)行固相萃取，萃取柱經(jīng)超純水洗滌3次后，采用乙醇洗脫結(jié)合于萃取柱上的葡萄糖苷（1.5 mL乙醇洗脫1次，2 mL超純水洗脫2次，收集3次洗脫液共5 mL）。取0.5 mL洗脫液向其中加入1mL2.25mol/LH2SO4，于100℃條件下水解1h，自然冷卻至室溫。隨后，向反應(yīng)液中加入1mL2.25mol/L NaOH，中和H2SO4。采用葡萄糖苷檢測試劑盒與分光光度計(jì)于波長340 nm處檢測上述溶液的吸光度值（OD340nm）。另制備系列濃度梯度的葡萄糖溶液（1～20mmol/L，每2mmol/L一個梯度），經(jīng)葡萄糖苷檢測試劑盒處理后，測定其OD340nm值，制備葡萄糖含量與OD340nm值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定發(fā)酵液中剩余的葡萄糖苷的量（葡萄糖苷的物質(zhì)的量濃度等于其水解后葡萄糖的物質(zhì)的量濃度）。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，取3次重復(fù)的平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。采用SPASS19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，P＜0.05視為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母細(xì)胞透化效果

未透化處理的5株酵母菌株均未檢測到胞外ADH活性。因此經(jīng)透化處理后，酵母菌株的胞外ADH活性能夠反映透化處理的效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 透化處理后酵母菌株ADH活性Table 1 ADH activity in yeast strains after permeabilization

由表1可以看出，5株酵母菌株均表現(xiàn)出胞外ADH活性，其中以釀酒酵母為最高，為（10.72±0.42）U，其次為葡萄汁有孢漢遜酵母及異常畢赤酵母，星型假絲酵母及淺黃隱球酵母酶活性最低。這一結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)條件下5株酵母菌株的胞壁均可被成功透化，從而為后續(xù)胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶活性的研究提供了理論依據(jù)。不同菌株ADH活性的差異可能由于其自身的ADH活性高低不同，也可能由于不同菌株經(jīng)透化處理后胞壁的透化程度不同。

2.2 酵母菌株單一或混合接種的發(fā)酵能力

酵母菌強(qiáng)勁的發(fā)酵能力是葡萄酒釀制的基本條件。因此，本研究在采用釀酒酵母與4株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的非釀酒酵母混合發(fā)酵時，不同菌株搭配時的發(fā)酵能力是首先需要考慮的問題，其發(fā)酵結(jié)果見表2。

表2 酵母菌株單一或混合接種的發(fā)酵能力比較Table 2 Comparison of fermentation performance of yeast strains with single or mixed inoculation way

由表2可以看出，當(dāng)釀酒酵母單獨(dú)發(fā)酵時，其發(fā)酵能力較強(qiáng)，然而當(dāng)其被透化處理后，發(fā)酵能力迅速下降，甚至喪失了發(fā)酵能力。這一結(jié)果表明，透化處理會導(dǎo)致大量酵母細(xì)胞自溶及死亡。因此既想利用釀酒酵母強(qiáng)勁的發(fā)酵能力，又想利用其胞內(nèi)的β-葡萄糖苷酶，兩個目標(biāo)無法同時實(shí)現(xiàn)?；诖?，采用未透化處理的釀酒酵母與非釀酒酵母按1∶1的比例接種，觀察其發(fā)酵能力?？芍切渭俳z酵母外，其他3株透化或未透化處理的非釀酒酵母與釀酒酵母混合接種時，對發(fā)酵力的影響不大。釀酒酵母與星形假絲酵母混合發(fā)酵時的低發(fā)酵能力可能在于不同酵母菌株間的相互作用，具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

2.3 不同酵母菌株組合對發(fā)酵液中葡萄糖苷的水解能力

于發(fā)酵結(jié)束后，對上述發(fā)酵液中的葡萄糖苷糖濃度進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖1。

圖1 不同酵母菌株組合對發(fā)酵液中葡萄糖苷濃度的影響Fig.1 Effects of combination of different yeast strains on glucoside concentration in fermentation broth

由圖1可以看出，除星形假絲酵母外，其他3種非釀酒酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵時，發(fā)酵液中的葡萄糖苷濃度均得到顯著降低（P＜0.05）。這一結(jié)果表明，這3株非釀酒酵母具有較高的β-葡萄糖苷酶活性，其中尤以萄萄汁有孢漢遜酵母及異常畢赤酵母的β-葡萄糖苷酶活性最高。此外，經(jīng)透化處理后，2株非釀酒酵母（萄萄汁有孢漢遜酵母及異常畢赤酵母）與釀酒酵母混合發(fā)酵時，發(fā)酵液中的葡萄糖苷濃度得到進(jìn)一步降低至濃度分別為3.04mmol/L和2.66mmol/L。這一結(jié)果表明，透化處理可使這2株菌的胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶發(fā)揮水解葡萄糖苷的作用。淺黃隱球酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵也可顯著降低發(fā)酵液中的葡萄糖苷濃度（P＜0.05），然而是否透化處理對發(fā)酵液中的葡萄糖苷濃度的影響不大（P＞0.05）。其原因可能在于這1株淺黃隱球酵母的胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶活性較低，或細(xì)胞透化處理效果欠佳，從而導(dǎo)致胞內(nèi)酶無法發(fā)揮水解作用。

結(jié)合上述發(fā)酵能力檢測結(jié)果，釀酒酵母與透化處理的葡萄汁有孢漢遜酵母或異常畢赤酵母按1∶1配比接種發(fā)酵葡萄汁，在對總體發(fā)酵結(jié)果影響不大的情況下，可顯著降低發(fā)酵液中的葡萄糖苷濃度（P＜0.05）。

2.4 討論

酵母細(xì)胞的β-葡萄糖苷酶主要分布于其細(xì)胞內(nèi)或與細(xì)胞壁相結(jié)合[6，8]，為此，本實(shí)驗(yàn)預(yù)先對部分酵母細(xì)胞進(jìn)行透化處理，并采用檢測處理后酵母細(xì)胞的ADH酶活性確定透化處理的效果，這種方法被前人廣泛采用，透化處理后的酵母細(xì)胞顯示更高的β-葡萄糖苷酶活性[5-6]。透化處理破壞了酵母細(xì)胞壁及細(xì)胞膜的完整性，最終導(dǎo)致細(xì)胞自溶及死亡。因此，采用釀酒酵母與非釀酒酵母混合發(fā)酵是解決這一問題的思路。

在葡萄汁自發(fā)發(fā)酵的早期，釀酒酵母與大量非釀酒酵母共同存在于發(fā)酵液中，其中，非釀酒酵母有助于起始自發(fā)的發(fā)酵過程，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，發(fā)酵液中酒精濃度逐漸升高，非釀酒酵母由于低酒精耐受力而受到抑制甚至死亡，而酒精耐受力強(qiáng)的釀酒酵母逐漸占據(jù)支配地位，最終主導(dǎo)發(fā)酵的完成[1，11]。為了增加或改善葡萄酒的香氣與風(fēng)味，釀酒酵母與非釀酒酵母混合接種發(fā)酵被廣泛研究，結(jié)果表明一些非釀酒酵母可提高葡萄酒中的萜醇、芳香酯等物質(zhì)，降低乙酸等物質(zhì)[12-14]。釀酒酵母與星形假絲酵母混合接種發(fā)酵能力低，可能在于不同酵母菌株間復(fù)雜的相互作用[15]。葡萄汁中絕大多數(shù)單萜醇類芳香物與葡萄糖或二糖以葡萄糖苷鍵相結(jié)合的形式存在[1-2]，因此，進(jìn)一步檢測發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液中葡萄糖苷的濃度，據(jù)此可以間接反映非釀酒酵母中β-葡萄糖苷酶的活性。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，透化處理對5個酵母菌株都具有一定的胞壁穿孔作用。透化處理使釀酒酵母喪失了發(fā)酵能力，因此發(fā)酵初期將釀酒酵母與透化或未透化處理的非釀酒酵母混合接種于葡萄汁中，除星形假絲酵母外，釀酒酵母與其他3株透化或未透化處理的非釀酒酵母混合接種對發(fā)酵結(jié)果的影響不大（P＞0.05），且可顯著降低發(fā)酵液中葡萄糖苷類物質(zhì)的濃度（P＜0.05），其中尤以萄萄汁有孢漢遜酵母及異常畢赤酵母的能力最強(qiáng)，葡萄糖苷類物質(zhì)的濃度分別為3.04 mmol/L和2.66 mmol/L。