王根杰，李德美*，張亞東，辛 聞，王宗義

（北京農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測與控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206）

氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）天然存在于大多數(shù)發(fā)酵食品如面包、牛奶等和酒精飲料（啤酒、白酒、葡萄酒等）中[1]。

早在20世紀(jì)70年代，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)EC具有潛在的致癌作用[2]。在葡萄酒釀造過程中，酵母代謝精氨酸產(chǎn)生尿素，當(dāng)尿素產(chǎn)量過高時(shí)，會從酵母細(xì)胞內(nèi)釋放到葡萄汁中，與發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇結(jié)合生成EC，這也是產(chǎn)生EC的主要途徑。在酒精發(fā)酵過程中，酵母優(yōu)先利用的氮源為銨態(tài)氮、游離α-氨基酸（脯氨酸除外）和小分子多肽，統(tǒng)稱為酵母可同化氮（yeast assimilable nitrogen，YAN）[3]。而葡萄汁中的YAN含量主要與土壤中的銨態(tài)氮含量有關(guān)[4]。

近年來，隨著我國國民生活水平的不斷提高，葡萄酒的消費(fèi)量也日益增長。據(jù)有關(guān)研究報(bào)道，我國預(yù)計(jì)在2020年將成為世界第二大葡萄酒消費(fèi)國[5]。然而，我國目前還沒有規(guī)定葡萄酒中的EC限量標(biāo)準(zhǔn)，葡萄酒質(zhì)量安全仍然存在很大的隱患。

目前國內(nèi)對于葡萄酒中EC的研究主要多為尿素、精氨酸、瓜氨酸等對葡萄酒中EC含量的影響，以及發(fā)酵溫度、貯存溫度、乳酸菌等對葡萄酒中EC含量的影響[6-8]。本試驗(yàn)的葡萄園地屬延懷河谷，土壤較為貧瘠，土壤缺氮較為嚴(yán)重[9]。因此在葡萄酒發(fā)酵過程中需要補(bǔ)充一定的氮源保證發(fā)酵順利進(jìn)行。然而，酵母營養(yǎng)劑的用量對EC產(chǎn)量的影響，且EC產(chǎn)量的變化規(guī)律及不同酵母對EC產(chǎn)量的影響研究也相對較少。因此，本試驗(yàn)采用穩(wěn)定同位素稀釋-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定葡萄酒中的EC含量，研究了葡萄酒釀造過程中不同酵母和不同酵母營養(yǎng)劑用量對葡萄酒中EC產(chǎn)量的影響，同時(shí)闡明葡萄酒中EC的含量與葡萄園土壤和葡萄汁中的氮含量之間的關(guān)系，為實(shí)際生產(chǎn)提供參考，同時(shí)為我國制定葡萄酒中EC限量標(biāo)準(zhǔn)提供基礎(chǔ)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒葡萄原料霞多麗（Chardonnay）、葡萄園土壤樣品：河北懷來紅葉酒莊；商業(yè)釀酒酵母（Saccharomyces cere visiae）X5、X16、RMS2、酵母營養(yǎng)劑（THIAZOTE）：法國Laffort公司；銨離子氮試劑盒（96 Assays per kit）、氨基酸態(tài)氮試劑盒（100 Assays per kit）：愛爾蘭Megazyme International Ireland有限公司。

氯化鉀、硝酸鉀、氫氧化鈉、磷酸鈉、磷酸氫二鈉、次氯酸鈉、酒石酸鉀鈉、硫酸銨（均為分析純）：北京藍(lán)弋試劑公司；甲醇、冰醋酸（色譜級）：美國Mreda公司；乙腈（色譜級）：韓國SK chemicals公司；氨基甲酸乙酯（EC）標(biāo)準(zhǔn)品、氨基甲酸乙酯內(nèi)標(biāo)化合物（EC-d5）：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV9100雙波長紫外分光光度計(jì)：北京Lab-Tech公司；6410 Triple Quad液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）（配化學(xué)工作站軟件B.02.01版）：美國Agilent公司；HealForceRSuperSeries NW超純水系統(tǒng)：上海Canrex分析儀器有限公司；MS3基本型渦旋混合器：德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的采集

本研究以河北懷來紅葉酒莊2016年霞多麗葡萄為實(shí)驗(yàn)材料。采收當(dāng)天，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)對葡萄園的1-1、1-2和1-3三個(gè)葡萄地塊進(jìn)行土樣的采集、處理和貯存，測定土壤中的銨態(tài)氮含量。葡萄采樣結(jié)束后，盡快送到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行壓榨與澄清處理，同時(shí)取葡萄汁（含糖量265 g/L、酸度（酒石酸計(jì)）為8.68g/L、pH值為3.20、葡萄汁初始密度為1.098）樣品，貯存于-20℃低溫冰箱待測。

1.3.2 霞多麗葡萄酒的發(fā)酵工藝及操作要點(diǎn)

按照干白葡萄酒發(fā)酵工藝進(jìn)行，不進(jìn)行蘋-乳發(fā)酵，霞多麗葡萄酒工藝流程如下：

操作要點(diǎn)：

（1）葡萄酒在除梗破碎過程中添加SO2（30 mg/L偏亞硫酸鉀），減少原料的氧化。

（2）葡萄原料經(jīng)過壓榨后，在10℃以下低溫澄清24 h。

（3）酵母菌接種量為0.2g/L，溫度范圍控制在15～20℃，在酒精度、還原糖含量基本不變時(shí)終止發(fā)酵。

（4）發(fā)酵期間溫度范圍控制在15～20℃。發(fā)酵前期、中期階段，每12 h監(jiān)測溫度、密度；發(fā)酵末期階段，每8 h監(jiān)測溫度、密度。

1.3.3 方案設(shè)計(jì)

酵母種類的影響：選用生產(chǎn)常用的商業(yè)酵母X5、X16、RMS2研究發(fā)酵過程中不同酵母對EC產(chǎn)量的影響。根據(jù)酒莊實(shí)際生產(chǎn)，酵母菌接種量和酵母營養(yǎng)劑THIAZOTE添加量均為0.2 g/L。酵母接種前需要在37℃左右水溫中活化20～30 min。

酵母營養(yǎng)劑用量的影響：本試驗(yàn)以酵母X16（酒莊發(fā)酵霞多麗葡萄酒的酵母）接種量為0.2 g/L進(jìn)行酵母營養(yǎng)劑不同用量對葡萄酒中EC產(chǎn)量影響的研究，酵母營養(yǎng)劑用量為0、0.3g/L、0.6g/L，以下分別記為YNCK、YN0.3和YN0.6。

上述6個(gè)處理均設(shè)置3次重復(fù)，共18個(gè)發(fā)酵單元。分別在發(fā)酵初期階段（密度為1.090）、中期（密度為1.040）和末期階段（密度為1.010）取樣測定葡萄酒中的EC產(chǎn)量。

1.3.4 指標(biāo)測定與方法

（1）土壤中銨態(tài)氮含量的測定[10]

土壤中銨態(tài)氮（NH4+-N）含量的測定采用氯化鉀（KCl）浸提-靛藍(lán)比色法，其計(jì)算公式如下：

式中：C為顯色液銨態(tài)氮的含量，μg/kg；V為顯色液體積，mL；ts為分取倍數(shù)；m為土樣的質(zhì)量，g。

（2）葡萄汁中酵母可同化氮的測定[11]

采用試劑盒檢測氨基酸態(tài)氮和銨離子氮含量，計(jì)算公式如下：

ΔA=（A1-A2）樣-（A1-A2）空白

式中：X1為氨基酸態(tài)氮含量，mg/L；V為終體積，mL；MW為氮摩爾質(zhì)量，g/mol；ε為氮素在波長340 nm處的消光系數(shù)；d為光路距離，cm；v為樣品體積，mL。

ΔA=（A1-A2）樣-（A1-A2）空白

式中：X2為銨離子氮含量，mg/L；V為終體積，mL；MW為氮摩爾質(zhì)量，g/mol；ε為氮素在波長340 nm處的消光系數(shù)；d為光路距離，cm；v為樣品體積，mL。

可同化氮含量（mg/L）=X1+X2

（3）葡萄酒理化指標(biāo)的測定[12]

根據(jù)國標(biāo)GB 15038—2006《葡萄酒、果酒通用試驗(yàn)方法》中的直接碘量法測定葡萄酒中游離SO2和總SO2的含量。

（4）葡萄汁或葡萄酒中EC含量的測定

采用穩(wěn)定同位素稀釋-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13]測定葡萄汁及葡萄酒中EC含量。

樣品前處理：將酒樣搖勻，立即準(zhǔn)確取出1.00 mL于5 mL試管中，準(zhǔn)確加入25 μL 10 μg/mL的EC-d5內(nèi)標(biāo)工作液，旋渦振蕩5 s，吸取樣液過0.22 μm濾膜，待分析。

高效液相色譜（high efficiency liquid chromatography，HPLC）條件：XSELECT HSS T3色譜柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm），Zorbax Eclipse Plus-C18預(yù)柱（12.5 mm×2.1 mm，5μm）。柱溫為40℃，進(jìn)樣體積為10μL，流速為0.3mL/min；流動相A為0.1%（V/V）乙酸水溶液，B為乙腈；梯度洗脫順序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Procedures of gradient elution

質(zhì)譜條件：電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）正離子模式，多反應(yīng)離子監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）方式監(jiān)測，MRM參數(shù)見表2。干燥氮?dú)鉁囟葹?20℃，流速為10L/min；霧化器壓力20psi；噴霧毛細(xì)管電壓4000V。

表2 MRM參數(shù)Table 2 Parameters of multiple reaction monitoring

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)處理與分析采用SPSS22.0，對葡萄酒中的理化指標(biāo)進(jìn)行多重比較分析，酒精發(fā)酵過程中的溫度密度變化趨勢圖和EC產(chǎn)量圖分別用Origin 9.0和Excel繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄園土壤和葡萄汁中的氮含量與葡萄酒中的EC含量關(guān)系

葡萄酒發(fā)酵過程中酵母代謝精氨酸產(chǎn)生的尿素與乙醇結(jié)合是生成EC的主要途徑。由此可見，葡萄汁中的精氨酸是EC的主要前體物質(zhì)之一。氨基酸是葡萄酒發(fā)酵所需的重要氮源，而YAN含量是衡量葡萄汁中氮源是否充足的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)研究了土壤中和葡萄汁中的氮含量與葡萄酒中的EC含量關(guān)系，結(jié)果見表3。

表3 葡萄園土壤和葡萄汁中的含氮量、葡萄酒中的氨基甲酸乙酯含量Table 3 Nitrogen contents in soil and grape juice,and ethyl carbamate contents in wine

由表3可知，不同葡萄園地塊土壤中的銨態(tài)氮含量、葡萄汁中的YAN含量和葡萄酒中的EC含量均不同。土壤中的銨態(tài)氮含量越高，葡萄汁中的YAN含量越高，最終葡萄酒中的EC含量也相對越高。此外，可以看出葡萄酒中的EC含量均在5 μg/L以下，含量較低，這可能與最初土壤中的銨態(tài)氮含量較低有關(guān)。

2.2 葡萄酒中主要理化指標(biāo)的含量

酒精發(fā)酵結(jié)束后，葡萄酒經(jīng)自然澄清后，與酒泥分離，經(jīng)過澄清、過濾、裝瓶，置于瓶儲室（溫度在15～20℃，相對濕度在65%～70%）貯存3個(gè)月后取樣。檢測葡萄酒中的理化指標(biāo)含量，結(jié)果見表4。

表4 霞多麗葡萄酒中理化指標(biāo)檢測結(jié)果Table 4 Detection results of physicochemical indexes of Chardonnay wine

由表4可知，葡萄酒指標(biāo)含量均在正常范圍內(nèi)，符合葡萄酒國標(biāo)要求。說明葡萄酒發(fā)酵過程控制合理，葡萄酒狀態(tài)良好，滿足葡萄酒中EC含量測定對酒樣的要求。

2.3 發(fā)酵過程中酵母種類對葡萄酒中EC產(chǎn)量的影響

酵母是葡萄酒發(fā)酵過程中的重要因素，不僅會對葡萄酒的外觀、香氣和口感產(chǎn)生重大影響，同時(shí)也會產(chǎn)生大量微量的代謝產(chǎn)物[14]。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，酵母菌容易利用的谷氨酸、谷氨酰胺等小分子氮源越來越少，酵母菌開始代謝精氨酸、核苷酸等含氮化合物，其代謝產(chǎn)生的瓜氨酸、氨甲酰磷酸、尿素等分泌到酒體中，與已積累的乙醇反應(yīng)生成EC[15]。

發(fā)酵過程中不同酵母對霞多麗葡萄酒中EC產(chǎn)量的影響見圖1。由圖1可知，所研究的3種酵母的EC產(chǎn)量存在一定的差異。在發(fā)酵過程中，3種酵母的EC產(chǎn)量均呈逐步增長的趨勢。在發(fā)酵初期階段，酵母X16、RMS2和X5釀造的霞多麗葡萄酒中均有少量EC產(chǎn)生。在發(fā)酵末期階段，3種酵母釀造的葡萄酒中EC產(chǎn)量均達(dá)到較大值。酵母X5、RMS2與X16相比，發(fā)酵末期階段釀造的葡萄酒中EC產(chǎn)量分別增長了53.8%和17.6%，說明葡萄酒中的EC產(chǎn)量與酵母的菌種特性和氮代謝能力有關(guān)，這與于英等[15]研究結(jié)果一致。

圖1 不同酵母種類在發(fā)酵過程中對葡萄酒中氨基甲酸乙酯產(chǎn)量的影響Fig.1 Effects of different yeast type on ethyl carbamate contents during wine fermentation process

2.4 不同酵母營養(yǎng)劑用量對葡萄酒中EC產(chǎn)量的影響

在酒精發(fā)酵過程中，酵母需要一定量的含氮化合物進(jìn)行生長繁殖。否則，發(fā)酵會因氮源物質(zhì)的缺乏而延緩甚至停滯[16]。酵母營養(yǎng)劑的成分主要是磷酸氫二銨，可以補(bǔ)充酵母所需氮源，加快發(fā)酵速率。而過量的磷酸氫二銨也會產(chǎn)生EC[17]。不同酵母營養(yǎng)劑用量對霞多麗葡萄酒中EC產(chǎn)量的影響結(jié)果見圖2。

圖2 不同酵母營養(yǎng)劑用量在發(fā)酵過程中對葡萄酒中氨基甲酸乙酯產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of different yeast nutrients addition on ethyl carbamate contents during wine fermentation process

由圖2可知，在發(fā)酵初期階段，添加酵母X16后，葡萄發(fā)酵液中未產(chǎn)生EC，可能與EC產(chǎn)量在檢測限以下有關(guān)，也說明發(fā)酵初期階段EC產(chǎn)量較低。在發(fā)酵中期階段添加酵母營養(yǎng)劑后，酵母營養(yǎng)劑不同用量處理釀造的葡萄酒中EC產(chǎn)量與發(fā)酵前期階段相比均有增長，且YN0.3、YN0.6均比對照組YNCK釀造的葡萄酒中的EC產(chǎn)量高。與發(fā)酵中期階段相比，YNCK、YN0.3、YN0.6在發(fā)酵末期階段的EC產(chǎn)量分別增長了73.3%、95.0%、76.0%，表明酵母營養(yǎng)劑的使用有提高EC產(chǎn)量的風(fēng)險(xiǎn)。而在發(fā)酵末期階段，酵母營養(yǎng)劑不同用量釀造的葡萄酒中的EC產(chǎn)量有一定的差異，與YNCK相比，YN0.3和YN0.6釀造的葡萄酒中的EC產(chǎn)量分別增加了12.8%、69.2%。結(jié)果顯示，隨酵母營養(yǎng)劑用量增加，釀造的葡萄酒中的EC產(chǎn)量增大。

2.5 葡萄酒中的EC含量

表5 不同處理葡萄酒中的氨基甲酸乙酯含量測定結(jié)果Table 5 Determination results of ethyl carbamate contents in wine with different treatments

由表5可知，不同發(fā)酵處理釀造的葡萄酒中的EC含量不同。酵母X5釀造的葡萄酒中的EC含量最高，X16釀造的葡萄酒中的EC含量最低。發(fā)酵末期階段，各發(fā)酵處理釀造的葡萄酒中的EC含量均有所下降。這與朱亞楠等[18]測定葡萄酒新酒中的EC含量較低的結(jié)果相一致，且含量水平均低于10 μg/L，符合美國或歐盟的EC含量限定標(biāo)準(zhǔn)[19]。

3 結(jié)論

不同酵母和酵母營養(yǎng)劑不同用量對霞多麗葡萄酒中EC產(chǎn)量影響的研究結(jié)果表明，發(fā)酵過程中，不同酵母種類釀造的葡萄酒中的EC產(chǎn)量不同，最終酵母X5、RMS2和X16釀造的葡萄酒中EC含量分別為3.8μg/L、3.0μg/L和2.1μg/L。在本試驗(yàn)中，不同酵母釀造的葡萄酒中的EC產(chǎn)量之間無明顯差異。不同酵母營養(yǎng)劑用量對霞多麗葡萄酒中的EC產(chǎn)量影響的研究表明，發(fā)酵過程中，隨著酵母營養(yǎng)劑用量的增加，葡萄酒中的EC產(chǎn)量越大，說明酵母營養(yǎng)劑的添加有提高EC含量的風(fēng)險(xiǎn)。在發(fā)酵末期階段，與對照相比，酵母營養(yǎng)劑THIAZOTE添加量為0.3 g/L和0.6 g/L釀造的葡萄酒中EC產(chǎn)量分別增加了12.8%和69.2%。葡萄酒發(fā)酵過程中，在酵母X16接種量為0.2 g/L的條件下，不添加酵母營養(yǎng)劑釀造的葡萄酒中EC產(chǎn)量相對最低。但在實(shí)際生產(chǎn)中，酵母營養(yǎng)劑的添加量要根據(jù)葡萄發(fā)酵液中的酵母可同化氮含量確定。在實(shí)驗(yàn)葡萄園現(xiàn)有的土壤氮素營養(yǎng)水平下，生產(chǎn)采用的酵母與酵母營養(yǎng)劑類型和用量，所釀造的葡萄酒EC產(chǎn)量范圍為2.1～3.8 μg/L，均未超過美國或歐盟限量水平。

在本試驗(yàn)中，盡管采用不同酵母和不同酵母營養(yǎng)劑用量釀造的霞多麗葡萄酒中的EC產(chǎn)量之間差異較小，但是可以說明葡萄酒經(jīng)過發(fā)酵后EC產(chǎn)量均處于較低水平。另一方面，本試驗(yàn)說明葡萄園土壤中的銨態(tài)氮含量會最終影響葡萄酒中的EC含量，因此對于氮肥的合理施用有一定的指導(dǎo)意義。此外，葡萄酒的品質(zhì)不僅僅是由發(fā)酵過程決定的，還包括橡木桶陳釀、調(diào)配工藝、貯藏溫度等因素。而這些因素也會對葡萄酒中EC含量產(chǎn)生影響，因此還需要結(jié)合起來進(jìn)一步研究。