劉燦珍，秦偉帥，孫玉霞，趙新節(jié)*

（1.齊魯工業(yè)大學 山東省微生物工程重點實驗室，山東 濟南 250353；2.山東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品研究所，山東 濟南 250100）

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作為二倍體微生物，在酒類發(fā)酵方面的應用較為廣泛，是酒類發(fā)酵的主導菌株。其代謝中產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物包括高級醇（杏仁和花的氣味）、乙酸酯、乙基酯（水果和花香味）、中長鏈的揮發(fā)性酸（干酪和汗的氣味）、醛類（奶油、水果和堅果氣味）等[1]，對酒類風味有重要影響。高級醇是指≥3個碳原子的一元醇類（雜醇油），是酵母在酒精發(fā)酵過程的代謝副產(chǎn)物，其含量對酒類的香氣和品質(zhì)有很大影響，是評價酒質(zhì)量的重要指標之一[3]。適量的高級醇會增加酒體的香氣復雜性，是酒體香氣的重要貢獻者，但過量可能會導致腦性癱瘓，影響人體健康[5]，因此在不影響酒風味的前提下，降低高級醇的含量具有重要意義。該文綜述了高級醇的主要代謝路徑及部分關(guān)鍵基因，以期為構(gòu)建應用于工業(yè)生產(chǎn)的低產(chǎn)高級醇菌株提供理論基礎。

1 高級醇代謝的相關(guān)途徑

高級醇的代謝包括埃里希途徑（Ehrlich）和合成代謝途徑（Harris）。高級醇形成的前體物質(zhì)α-酮酸由氨基酸的轉(zhuǎn)氨作用形成，之后經(jīng)線粒體和胞質(zhì)支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶（branched-chain amino acid transaminase，BCAATases）催化[4]，由α-酮酸經(jīng)脫羧形成醛，并轉(zhuǎn)化為相應的雜醇，稱為埃里希途徑[5]。若α-酮酸來源于碳水化合物代謝，則稱為高級醇的合成代謝途徑[4]。

1.1 埃里希途徑

GIUDICI P等[6]用釀酒酵母研究了氨基酸形成高級醇的形成機制，指出形成高級醇的埃里希途徑為：氨基酸在轉(zhuǎn)氨、脫羧、還原作用下經(jīng)酮酸、醛最終形成相應的高級醇（比與原氨基酸少1個碳）。之后對該途徑在酶及基因調(diào)控方面進行了豐富，有研究發(fā)現(xiàn)[7]，支鏈氨基酸通過支鏈氨基酸通透酶（由BAP2基因編碼），轉(zhuǎn)運至細胞；然后由BAT1編碼的線粒體轉(zhuǎn)氨酶作用催化氨基酸為α-酮酸，基因BAT2參與胞質(zhì)支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶的作用，催化α-酮酸合成氨基酸的路徑；最后經(jīng)2-酮基酸脫羧酶（2-keto-acid decarboxylase，KDCs）脫羧，脫氫酶（dehydrogenase，ADHs）還原為高級醇。苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、蛋氨酸也通過該途徑生成相應高級醇。

1.2 合成途徑

合成途徑（如圖1所示）是由葡萄糖代謝的中間產(chǎn)物α-酮酸，經(jīng)2-酮基酸脫羧酶（KDCs）脫羧、脫氫酶（ADHs）脫氫還原成高級醇[3]。葡萄糖經(jīng)糖代謝生成丙酮酸，再轉(zhuǎn)化為α-酮丁酸、α-異酮戊酸、α-酮異己酸，最后分別生成活性戊醇、異丁醇、異戊醇。其中活性戊醇途徑為：α-酮丁酸分別在乙酰乳酸合酶（ILV1基因編碼）、還原酶（ILV5基因編碼）、脫水酶（ILV3基因編碼）作用下催化為α-酮-3-甲基戊酸，再經(jīng)脫羧、還原作用形成；異丁醇途徑為：由α-酮異戊酸經(jīng)脫羧作用形成異丁醛，再經(jīng)還原作用形成異丁醇；異戊醇途徑：α-酮基異己酸形成異戊醛，再還原為異戊醇，其中α-酮丁酸在ILVs基因編碼的相關(guān)酶催化下轉(zhuǎn)化為α-酮基異戊酸，在LEU4、LEU1基因編碼的相關(guān)酶的催化下，可轉(zhuǎn)化為α-酮異己酸[7]。而形成α-酮丁酸的途徑有3條，丙酮酸途徑：丙酮酸經(jīng)LEU1基因編碼的異丙基蘋果酸合成酶催化為β-蘋果酸甲酯，β-蘋果酸甲酯再轉(zhuǎn)化為α-酮丁酸，其中α-酮異戊酸到α-酮異己酸（亮氨酸合成途徑的前體物質(zhì)）的轉(zhuǎn)化也需要LEU1基因參與，因此，該基因的缺失可能對高級醇及亮氨酸的合成造成一定影響；天冬氨酸途徑：天冬氨酸轉(zhuǎn)化為高絲氨酸，高絲氨酸在THR4基因編碼的蘇氨酸合成酶催化下合成蘇氨酸，蘇氨酸經(jīng)ILV1基因編碼的蘇氨酸脫氫酶作用，轉(zhuǎn)化為α-酮丁酸[8]；高絲氨酸合成途徑[7]：可能是高絲氨酸轉(zhuǎn)化為中間物質(zhì)O-乙酰高絲氨酸、胱硫醚，最后形成最終產(chǎn)物α-酮丁酸，該途徑未見詳細報道（如圖2所示）。

圖1 高級醇代謝通路Fig.1 Metabolic pathways of higher alcohol

圖2 天冬氨酸合成α-酮丁酸途徑Fig.2 Synthesis pathway of α-keto butyric acid using aspartic acid

2 高級醇調(diào)控關(guān)鍵基因及功能

2.1 埃里希途徑中關(guān)鍵基因及功能

2.1.1 BAP2基因

釀酒酵母BAP2基因編碼支鏈氨基酸通透酶，該酶參與3種支鏈氨基酸包括亮氨酸，異亮氨酸和纈氨酸的轉(zhuǎn)運，底物特異性較廣泛[9]，上述3種氨基酸可通過埃里希途徑形成高級醇[10]。GRAUSLUND M等[9]研究發(fā)現(xiàn)，BAP2基因的缺失導致亮氨酸，異亮氨酸和纈氨酸利用量減少20%～50%。也有研究發(fā)現(xiàn)BAP2基因的組成型表達導致異戊醇生產(chǎn)增加，因此BAP2基因表達和高級醇的形成之間存在一定的相關(guān)性[11]。

2.1.2 BAT1、BAT2基因

Bat1p和Bat2p酶分別位于線粒體和細胞溶質(zhì)，分別催化支鏈氨基酸和α-酮酸間氨基的轉(zhuǎn)運，而α-酮酸是合成高級醇的前體，因此會間接影響酵母發(fā)酵產(chǎn)生的口感和香氣[12]。YOSHIMOTO H 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，BAT1和BAT2基因分別編碼Bat1p和Bat2p兩個支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶（BCAATases）。BAT2基因參與支鏈醇、乙酸異戊酯的生產(chǎn)，BAT2基因缺失突變體KY1058與野生型相比，異戊醇、異丁醇的量分別減少40%、72%[13]，另一方面過表達BAT2基因，異戊醇、異丁醇量分別增加幾倍[14]。此外，雙敲除BAT1和BAT2基因的單倍體釀酒酵母，仍能產(chǎn)生異戊醇[15]，表明其他酶能夠補償支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶缺失帶來的影響。此外，有研究表明，Bat1p優(yōu)先參與支鏈氨基酸的合成，Bat2p參與纈氨酸的分解代謝，表明了支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶的功能多樣化[16]。MA L等[17]敲除CAR1、BAT2并過表達BAT1基因構(gòu)建了一株低產(chǎn)氨基甲酸乙酯同時低產(chǎn)高級醇的酵母菌株。

2.1.3 ARO基因

芳香族氨基酸苯丙氨酸經(jīng)苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ARO8基因編碼）、脫羧酶（ARO10基因編碼）催化形成β-苯乙醇，脫羧酶是β-苯乙醇生物合成途徑的關(guān)鍵酶，過表達ARO10基因β-苯乙醇的產(chǎn)量提高[18]。ARO80、CAT8、MIG1是β-苯乙醇合成重要轉(zhuǎn)錄因子，過表達CAT8基因或敲除MIG1基因均影響基因ARO9與ARO10的轉(zhuǎn)錄，使苯乙醇的產(chǎn)量增加[19]。而脫羧酶對轉(zhuǎn)氨產(chǎn)物α-氨酮基-γ-甲硫基-丁酸（蛋氨酸轉(zhuǎn)氨物）的脫羧作用尤為突出[20]，脫羧酶也是3-甲硫基丙醇生物合成中的關(guān)鍵酶，ARO10基因過表達使3-甲硫基丙醇的產(chǎn)量提高[21]。

2.1.4 HOM2基因

生物合成蘇氨酸、蛋氨酸的天冬氨酸β-半醛脫氫酶由HOM2基因編碼，因此HOM2基因表達可能會影響2種氨基酸的產(chǎn)量，從而導致高級醇含量的變化。ROBICHONSZULMAJSTER H等[22]提出，天冬氨酸β-半醛脫氫酶是埃里希途徑的關(guān)鍵酶。缺失HOM2基因的菌株，異丁醇和異戊醇的生成量顯著降低[23]。齊亞楠[24]研究了HOM2基因?qū)臧l(fā)酵能力與高級醇的影響，發(fā)現(xiàn)敲除HOM2的一個等位基因，對酵母菌的發(fā)酵性能沒有明顯影響，但異戊醇的生成量降低。敲除HOM2的2個等位基因則嚴重影響酵母菌生長，同時高級醇含量明顯降低。這可能是由于天冬氨酸β-半醛脫氨酶影響了埃里希代謝途徑，也可能是菌體自身生長減弱造成的。

2.2 合成途徑關(guān)鍵基因及功能

2.2.1 LEU基因

異丙基蘋果酸合成酶由LEU1基因編碼，是形成α-酮丁酸和α-酮異戊酸到α-酮異己酸的轉(zhuǎn)化過程的重要編碼基因。因此該基因缺失會對丙酮酸到α-酮丁酸的形成途徑有阻斷作用，對正丙醇的產(chǎn)量產(chǎn)生影響；同時該基因缺失影響α-酮酸（α-酮異戊酸-α-酮異己酸）間的轉(zhuǎn)化，導致異戊醇產(chǎn)量降低；而α-酮異戊酸的積累也會導致異丁醇的生成量增加[25]。有研究通過敲除LEU1基因發(fā)現(xiàn)正丁醇、異戊醇的含量提高，同時發(fā)現(xiàn)LEU1基因的敲除，使ILV1基因（編碼蘇氨酸脫氫酶）表達上調(diào)[25]。LEU1是合成亮氨酸的關(guān)鍵基因，通過單敲除及雙敲除LEU1的等位基因發(fā)現(xiàn)異丙基蘋果酸脫氫酶的酶活降低，異戊醇、總高級醇的產(chǎn)量均降低[26]。LEU2基因編碼β-丙基蘋果酸脫氫酶，可催化β-丙基蘋果酸合成α-酮異己酸（異戊醇的前體）[6]，因此該基因缺失會減少α-酮異己酸的量，從而使異戊醇的產(chǎn)量下降，有研究敲除LEU2基因，異戊醇含量較出發(fā)菌株降低了11.82%，高級醇總量降低9.97%[6]。

2.2.2 ILV基因

與支鏈氨基酸合成相關(guān)的酶有4種，由ILV基因編碼。其中異亮氨酸的合成由蘇氨酸脫氨酶（ILV1基因編碼）、乙酰乳酸和酶（ILV2基因編碼）、乙酰羥酸還原酶（ILV5基因編碼）、脫水酶（ILV3基因編碼）、轉(zhuǎn)氨酶（BATs基因編碼）共同催化。同時在上述后4種酶的作用下丙酮酸催化為纈氨酸，纈氨酸是合成高級醇的前體物，因此ILV基因的表達會影響高級醇的合成[27]。在釀酒酵母中分別過量表達編碼4種酶的基因，異丁醇的產(chǎn)率均升高[28]。BOLLON A P[29]證明，釀酒酵母蘇氨酸脫氨酶參與催化異亮氨酸生物合成的第一步反應，而且也參與異亮氨酸-纈氨酸的生物合成的調(diào)控途徑。蘇氨酸脫氨酶催化蘇氨酸轉(zhuǎn)化為α-酮丁酸，有研究證明[30]ILV1基因的缺失對乙酰羥酸還原異構(gòu)酶和支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶的調(diào)節(jié)沒影響，但導致異丁醇生產(chǎn)率提高到3.5倍。同時EDEN A等[31]指出，ILV2基因缺失導致中間物α-酮丁酸積累，使正丙醇的生成量增加。

2.2.3 PDC基因

脫羧酶由PDC1、PDC5、PDC6、YDL080c或YDR380w基因編碼，使酵母能利用α-酮-β-甲基戊酸[32]。過表達釀酒酵母的ILV2、KDC、ADH基因，并且敲除PDC1基因（編碼丙酮酸脫羧酶），發(fā)現(xiàn)異丁醇的產(chǎn)率是出發(fā)菌株的13倍[33]，原因可能是丙酮酸合成乙醇的途徑受到抑制，從而導致過多的碳源流向埃里希途徑，進而增加了異丁醇產(chǎn)量。也有研究發(fā)現(xiàn)[33]，敲除編碼丙酮酸脫氫酶復合體（負責將丙酮酸催化為乙酰輔酶A（coenzyme A，CoA））的基因：PDA1、PDB1、LAT1或LPD1基因，導致異丁醇生產(chǎn)更多。敲除編碼丙酮酸脫羧酶的同工酶基因PDC1基因，導致異丁醇產(chǎn)量增加[34]。類酮酸脫羧酶（YDL080c基因編碼），是α-酮異己酸生成異戊醇的關(guān)鍵酶，研究發(fā)現(xiàn)[34]，敲除該基因不能合成類丙酮酸脫羧酶，導致異戊醇的產(chǎn)量顯著減少，可能是由于糖代謝合成高級醇的途徑受阻后，氨基酸代謝為高級醇的分解途徑活躍，而高級醇產(chǎn)量主要來自于糖代謝，因此異戊醇的產(chǎn)量下降。但也有研究發(fā)現(xiàn)，YDL080c基因缺失并未造成異戊醇的生成量的降低[35]。

3 展望

高級醇的研究開始于1906年，經(jīng)過110多年的發(fā)展，相關(guān)研究已經(jīng)從生化分析階段進入到分子生物學階段。目前對高級醇的研究已取得很大進展，并且不斷豐富高級醇的代謝路徑，找到了高級醇的部分代謝通路及調(diào)控基因。該文綜述了部分高級醇形成路徑埃里希途徑、合成途徑及主要的調(diào)控基因BAP2、BAT1、BAT2、LEU、ILV、THR4、PDC、ARO、HOM2，由于上述基因是埃里希途徑及合成途徑的關(guān)鍵基因，因此綜述上述基因?qū)τ诶斫飧呒壌嫉拇x具有重要意義。目前在高級醇的研究方面由集中于高級醇產(chǎn)量的影響因素和通過何種生產(chǎn)工藝控制高級醇的產(chǎn)量方面，進一步深入研究高級醇代謝機理，以期通過分子生物學的方式將釀酒酵母進行菌種改造，從而達到工業(yè)生產(chǎn)的要求。然而通過基因工程手段構(gòu)建高產(chǎn)酯，低產(chǎn)高級醇的酵母菌株也存在相應問題，如構(gòu)建的酵母菌株中存在抗生素選擇標記，因此在應用于工業(yè)生產(chǎn)方面還存在安全問題。同時，對于基因調(diào)控、各通路間相關(guān)關(guān)系方面還存在研究空間。因此在研究代謝通路的同時，也應在工業(yè)應用及發(fā)酵條件對高級醇調(diào)控基因的表達方面繼續(xù)研究。