馬 亮， 李 飛， 張金寶， 吳國峰， 陳宗全， 王曉玲， 譚陽光， 王清連

(現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心/河南科技學(xué)院棉花研究所，河南新鄉(xiāng) 453003)

陸地棉(GossypiumhirsutumL.)是世界四大棉花栽培種之一，于19世紀(jì)末期傳入我國。目前，除新疆有種植少量海島棉外，我國大部分產(chǎn)棉區(qū)均種植陸地棉材料?；ㄑ糠只侵参镉蔂I養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變的重要生理和形態(tài)標(biāo)志，對花芽分化的研究始于1877年，Askenasy對酸櫻桃花芽分化作了相關(guān)報(bào)道[1]。棉花的花芽是形成棉鈴和纖維產(chǎn)量的基礎(chǔ)[2]，花芽分化的遲早影響到結(jié)鈴是否適期，花芽分化的多少關(guān)系到棉纖維產(chǎn)量的高低[3]，同時(shí)花芽分化與早熟也密切相關(guān)[4]，因此研究陸地棉花芽分化具有極其重要的意義。孫濟(jì)中等指出，陸地棉花芽分化按照各花器官原基向心分化的自然順序進(jìn)行，并將其劃分為花原基伸長期、苞片原基分化期、花萼原基分化期、花瓣原基分化期、雄蕊原基分化期和心皮分化期等6個(gè)時(shí)期[5]。此外，植物花芽分化是一個(gè)重要且復(fù)雜的形態(tài)建成過程，由內(nèi)外因子相互協(xié)調(diào)共同完成。馬煥普指出，在該過程中營養(yǎng)是花芽分化的基礎(chǔ)，內(nèi)源激素調(diào)節(jié)是花芽分化的關(guān)鍵，基因表達(dá)是花芽分化的途徑[6]。近年來，對花卉和果樹花芽分化的研究表明，高濃度的玉米素核素(ZR)能促進(jìn)花芽分化，而生長素(IAA)、脫落酸(ABA)和赤霉素(GA3)對花芽分化的作用尚不統(tǒng)一[7-9]。本試驗(yàn)試圖利用掃描電鏡觀察不同陸地棉花芽的形態(tài)分化，并在此基礎(chǔ)上分析上述4種內(nèi)源激素含量及比例的變化，以期了解花芽分化的生理學(xué)基礎(chǔ)，為陸地棉花期的化學(xué)調(diào)控和品種最適移栽期研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為不同熟性的4個(gè)陸地棉品種(百棉1號(hào)、中棉所41、魯棉研21號(hào)和DP99B)，種子均經(jīng)過多代自交，經(jīng)硫酸脫絨后曬干，選擇成熟飽滿的籽粒，2014年5月1日種植于河南科技學(xué)院輝縣棉花育種試驗(yàn)田，單行區(qū)，行長5 m，行距 1 m，每行15～17株，每個(gè)材料種植15行，按常規(guī)大田管理。

1.2 取樣與保存

供試材料取樣時(shí)期為1～8葉期，每個(gè)葉期分別取幼苗置于福爾馬林-乙酸-乙醇(formalin-aceto-alcohol，簡稱FAA)固定液中固定保存；另取莖尖若干，經(jīng)液氮罐速凍后，置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存待測。

1.3 解剖學(xué)觀察

對于保存于FAA固定液中的幼苗，切下其莖尖，在體視鏡下解剖，去除幼葉、較大葉原基和托葉等組織，露出生長點(diǎn)；然后用不同濃度的乙醇梯度脫水，叔丁醇逐步替換，4 ℃放置12 h；在真空干燥箱(BPZ-6033)中干燥后，粘貼于粘有雙面膠的鋁制樣品臺(tái)上，在掃描電鏡(Quanta 200)下使用15 kV電壓觀察拍照[10]。此外，幼苗各葉位的腋芽在體視鏡下解剖、觀察和記錄。

1.4 內(nèi)源激素含量的測定

在解剖學(xué)的基礎(chǔ)上，稱取供試材料的每個(gè)葉期0.2 g左右的樣品(保存于冰箱內(nèi)的莖尖)，稱取3次。內(nèi)源激素的提取、純化和含量的測定均由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院完成。其中，選用80%甲醇[內(nèi)含1 mmol/L 二丁基羥基甲苯(butylated hydroxytoluene，簡稱BHT)]作為提取液，C18固相萃取柱用于純化激素，采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)[11-12]進(jìn)行內(nèi)源激素含量(鮮質(zhì)量)的測定，試劑盒由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，測定激素為IAA、ABA、GA3和ZR，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 陸地棉花芽分化的解剖學(xué)觀察

參照孫濟(jì)中等對陸地棉花芽分化時(shí)期的劃分[5]，對陸地棉品種百棉1號(hào)的莖尖頂芽和側(cè)芽進(jìn)行精細(xì)解剖?；ㄔ扉L期(圖1-a)：腋芽生長錐伸長呈圓柱形突起；苞片原基分化期(圖1-b、圖1-c、圖1-d)：花原基先分化出1片邊緣光滑的半橢圓形苞片原基，隨后分化出第2和第3片苞片原基，同時(shí)隨著苞片原基的增大，邊緣出現(xiàn)鋸狀苞齒；花萼原基分化期(圖1-e、圖1-f)：苞片原基內(nèi)部形成5片環(huán)狀花萼原基，基部相連，頂部凸起；花瓣原基分化期(圖1-g、圖1-h)：花萼原基內(nèi)部組織繼續(xù)分化，中間凹陷，周圍出現(xiàn)1圈隆起，隨后圈狀隆起邊緣形成5個(gè)突起的花瓣原基。在陸地棉花芽分化的整個(gè)過程中，苞片原基分化期通常作為花芽形態(tài)分化開始的標(biāo)志，又稱為形態(tài)分化初期。

由圖2可知，4個(gè)品種花芽形態(tài)分化呈現(xiàn)出較大差異。百棉1號(hào)一般在3葉期即可觀察到5～6葉位已進(jìn)入苞片分化期；而中棉所41在5葉期才能觀察到6～8葉位進(jìn)入苞片分化期；魯棉研21號(hào)和DP99B 2個(gè)品種的花芽初始分化發(fā)生在6～7葉位，在4葉期可明顯觀察到分化。此外，在6葉期，百棉1號(hào)、魯棉研21號(hào)和DP99B 3個(gè)品種的第7葉位已進(jìn)入花瓣原基分化期，而中棉所41仍處于花萼原基分化期。值得指出的是，百棉1號(hào)、魯棉研21號(hào)、DP99B、中棉所41分別于3葉期、4葉期、4葉期、5葉期進(jìn)入花芽形態(tài)分化初期。

2.2 陸地棉花芽分化期間莖尖內(nèi)源激素含量的變化

2.2.1 GA3含量的變化 由圖3-a可知，在陸地棉花芽分化過程中的8個(gè)葉期，4個(gè)品種的GA3含量變化具有明顯差異。百棉1號(hào)在2葉期時(shí)，GA3含量略有降低，在3葉期出現(xiàn)最高峰，隨后逐漸降低；中棉所41在2葉期時(shí)，GA3含量稍有上升，隨后降低，在4葉期回升，在5葉期時(shí)出現(xiàn)最高峰，然后逐漸降低；魯棉研21號(hào)在1葉期時(shí)GA3含量較高，隨后降低，在3葉期出現(xiàn)低谷，緊接著4葉期迅速達(dá)到最高峰，然后5葉期降低至接近3葉期的水平，隨后緩慢上升；DP99B在3葉期時(shí)，GA3含量略有降低，4葉期出現(xiàn)最高峰，隨后降低，至6葉期出現(xiàn)低谷，然后緩慢上升。

2.2.2 ZR含量的變化 由圖3-b可知，4個(gè)陸地棉品種在8個(gè)葉期ZR含量的變化情況有所不同。百棉1號(hào)在3葉期時(shí)，ZR含量達(dá)到最大值，為11.8 ng/g，4葉期降低，隨后緩慢上升，6～8葉期緩慢降低；中棉所41在2葉期時(shí)ZR含量略有上升，3葉期稍有降低，隨后上升，至5葉期時(shí)出現(xiàn)最高峰，6葉期急速下降，7葉期稍有上升，8葉期略有降低；魯棉研21號(hào)在2葉期時(shí)ZR含量略有降低，隨后上升，4葉期具有最大值，為14.2 ng/g，接著下降，至7葉期出現(xiàn)最小值，在8葉期稍有上升；DP99B的ZR含量在1～4葉期逐漸上升，4葉期具有最大值，為12.3 ng/g，5葉期降低，隨后緩慢上升，8葉期略有降低。

2.2.3 ABA含量的變化 由圖4-a可知，4個(gè)陸地棉品種的ABA含量在花芽分化過程中呈現(xiàn)出相似的變化趨勢，即先逐漸上升，達(dá)到最高峰后再逐步下降。不同的是百棉1號(hào)在3葉期達(dá)到最高峰，中棉所41達(dá)到高峰時(shí)間為5葉期，而魯棉研21號(hào)和DP99B為4葉期。

2.2.4 IAA含量的變化 由圖4-b可知，花芽分化過程中4個(gè)陸地棉品種IAA含量的變化趨勢略有差異。百棉1號(hào)的IAA含量變化呈現(xiàn)出上升—下降—上升的趨勢，在3葉期出現(xiàn)最低谷；中棉所41和魯棉研21號(hào)均呈現(xiàn)出先下降再上升的趨勢，分別在5葉期和4葉期出現(xiàn)最低谷；DP99B呈現(xiàn)出下降—上升—下降—上升的趨勢，在4葉期出現(xiàn)最低谷。

2.3 花芽分化期間莖尖內(nèi)源激素比值的變化

由圖5、圖6、圖7可知，花芽分化期間4個(gè)陸地棉品種的內(nèi)源激素比值具有規(guī)律性變化。ZR/IAA、ABA/IAA和 GA3/IAA 值變化趨勢相似，整體上呈先逐步上升后急速下降最終趨于平緩的趨勢。其中，百棉1號(hào)的3個(gè)比值在3葉期達(dá)到最大值；中棉所41的3個(gè)比值在5葉期達(dá)到最大值；魯棉研21號(hào)和DP99B的3個(gè)比值在4葉期達(dá)到最大值。此外，魯棉研21號(hào)的ZR/IAA、GA3/IAA值在4個(gè)品種內(nèi)具有最高峰，分別為0.43、0.54；百棉1號(hào)的ABA/IAA值具有最高峰，為3.83。ZR/GA3和ABA/GA3值整體上均呈“M”形變化趨勢，百棉1號(hào)、中棉所41、魯棉研21號(hào)和DP99B 4個(gè)品種的 ZR/GA3值分別于3葉期、5葉期、4葉期和4葉期出現(xiàn)低谷。其中，魯棉研21號(hào)的變化趨勢最為明顯。

3 結(jié)論與討論

長期以來，我國糧棉爭地問題嚴(yán)重，陸地棉營養(yǎng)缽育苗是提高復(fù)種指數(shù)、實(shí)現(xiàn)糧棉雙豐收的有效措施。同時(shí)，與傳統(tǒng)種植方式相比，營養(yǎng)缽育苗在產(chǎn)量和質(zhì)量方面均有所提高。花芽分化作為植物由營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變的標(biāo)志，對育苗最適移栽期的選擇具有重要的指導(dǎo)意義。百棉1號(hào)在3葉期開始花芽分化，其最適移栽期即為3葉期。同樣，中棉所41的最適移栽期為5葉期，魯棉研21號(hào)和DP99B的最適移栽期為4葉期。

3.1 內(nèi)源激素與花芽分化的關(guān)系

赤霉素對種子萌發(fā)和植物生長具有促進(jìn)作用。目前，GA3作為一種抑花激素，在蘋果[13]、平陰玫瑰[14]、油橄欖[15]、芒果[16]、大櫻桃[17]、光皮樹[18]等植物中已有報(bào)道。但也有研究表明，GA3可以促進(jìn)植物花芽分化。程華等研究發(fā)現(xiàn)，GA3有利于板栗花序原基的形成，且花序原基分化期和花簇原基分化期均需要維持較高的GA3濃度[9]；在大蔥花芽分化期間，根、假莖和葉片中GA3含量逐漸上升，出現(xiàn)峰值的時(shí)間與完成花芽分化時(shí)期相吻合[19]。此外，GA3對花芽分化的作用可能與其類型有關(guān)。Ulger等指出，GA3濃度過高會(huì)抑制橄欖的花芽分化，然而高濃度的GA3對橄欖的成花有促進(jìn)作用[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，4個(gè)陸地棉品種的GA3含量均在花芽形態(tài)分化初期達(dá)到最大值，說明高濃度的GA3能促進(jìn)陸地棉花芽由營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)向生殖生長。

ZR作為細(xì)胞分裂素的一種，參與許多植物的成花轉(zhuǎn)變過程。李秉真等分別在對梨和柑橘的研究中發(fā)現(xiàn)，在花芽分化的各個(gè)時(shí)期，花芽中的ZR含量均高于葉芽[21-22]。油桐在花芽形態(tài)分化期，ZR含量呈現(xiàn)前期上升、中期波動(dòng)、末期上升的變化情況[23]。在本研究中，陸地棉的ZR含量在形態(tài)分化初期出現(xiàn)高峰，進(jìn)入形態(tài)分化期后開始下降，說明ZR對陸地棉花芽分化具有促進(jìn)作用。這與胡紹慶等關(guān)于桂花的研究結(jié)果[24]一致。

生長抑制劑ABA對花芽分化的作用說法不一。多數(shù)人認(rèn)為ABA是一種重要的促花激素[25-26]。郭蕊等對百合內(nèi)源激素與鱗莖休眠關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)，ABA可以打破休眠，是花芽開始分化的關(guān)鍵物質(zhì)[27]。Okuda等通過研究溫州蜜橘認(rèn)為，ABA可以同GA3拮抗，促進(jìn)花芽孕育[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，ABA在陸地棉花芽未分化時(shí)含量較低，隨著生長發(fā)育的進(jìn)行，ABA含量逐漸增高，到花芽形態(tài)分化初期達(dá)到最高峰，表明高濃度的ABA有利于陸地棉花芽分化。

IAA與植物成花的關(guān)系一直存在爭議。彭桂群等研究表明，IAA是一種抑花激素，能抑制平陰玫瑰的花芽分化[14]；而孔德政等對碗蓮的研究發(fā)現(xiàn)，較高濃度的IAA對碗蓮花芽分化起促進(jìn)作用[29]。目前普遍認(rèn)為，低濃度的IAA是花芽分化所必需的，但高濃度IAA能抑制開花。本研究中，4個(gè)陸地棉品種的IAA含量在花芽形態(tài)分化初期出現(xiàn)低谷，隨后有所升高，但升高幅度不大，說明低濃度的IAA有利于陸地棉花芽分化。

3.2 激素平衡與花芽分化的關(guān)系

雖然各類激素在陸地棉花芽分化過程中呈現(xiàn)出一定的變化規(guī)律，但植物成花并不是由單一的某種激素決定的，往往還依賴于激素之間的平衡。各種激素在時(shí)間和空間上相互作用、相互促進(jìn)、相互拮抗而形成一種動(dòng)態(tài)平衡，這種平衡是花芽分化能夠順利進(jìn)行的物質(zhì)基礎(chǔ)[30-31]。分析陸地棉花芽分化與激素平衡的關(guān)系表明，ZR/IAA、ABA/IAA和GA3/IAA值在陸地棉花芽分化期間呈現(xiàn)先上升后下降的過程，在花芽形態(tài)分化初期達(dá)到最大值。說明高水平的ZR/IAA、ABA/IAA和GA3/IAA值有利于陸地棉花芽分化，這與程華等對板栗的研究結(jié)果[9]一致。ZR/GA3和ABA/GA3值在花芽形態(tài)分化初期出現(xiàn)低谷，說明低水平的ZR/GA3和ABA/GA3值能促進(jìn)棉花由營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變。

總之，內(nèi)源激素和激素平衡對陸地棉花芽分化起著十分重要的作用，任何一種激素含量的變化都能影響花芽分化，因此可以借助化學(xué)調(diào)控外施相應(yīng)的內(nèi)源激素使花芽分化提前或者推遲。值得注意的是，不同熟性的陸地棉品種花芽分化的情況具有一定的差異，在花芽分化起始階段各類內(nèi)源激素的含量也不盡相同，如4個(gè)供試品種中雖然百棉1號(hào)花芽分化最早，但是花芽形態(tài)分化初期GA3含量卻并非最高。此外，核酸、蛋白質(zhì)、碳水化合物等也能影響陸地棉花芽分化，具體作用還有待進(jìn)一步研究探討。