楊 星，丁雙陽(yáng)，趙富華，馬秋冉，于曉輝*

(1.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100094)

非潑羅尼(Fipronil)又名氟蟲(chóng)腈，商品名為銳勁特，是一種苯基吡唑類(lèi)的廣譜殺蟲(chóng)劑，由法國(guó)羅納-普朗克公司研發(fā)[1]，通過(guò)與昆蟲(chóng)神經(jīng)中樞細(xì)胞膜上的γ-氨基丁酸(GABA)受體結(jié)合而阻塞神經(jīng)細(xì)胞的氯離子通道，從而干擾昆蟲(chóng)神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能而導(dǎo)致昆蟲(chóng)死亡[2]。雖然非潑羅尼活性高，對(duì)多種害蟲(chóng)有優(yōu)良的防效，但由于抗藥性風(fēng)險(xiǎn)、殘留風(fēng)險(xiǎn)和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)較大[3]，作為農(nóng)藥已被許多國(guó)家禁用。我國(guó)2009年發(fā)布農(nóng)業(yè)部第1157號(hào)公告：除衛(wèi)生用、玉米等部分旱田種子包衣劑外，在我國(guó)境內(nèi)停止銷(xiāo)售和使用用于其他方面的含氟蟲(chóng)腈成分的農(nóng)藥制劑。因此，非潑羅尼現(xiàn)在多用于防治寵物(貓/狗)身上的跳蚤/螨和虱子。2017年8月波及歐洲多國(guó)的“毒雞蛋”事件引發(fā)公眾對(duì)食品安全的再次關(guān)注，該批問(wèn)題雞蛋是由于氟蟲(chóng)腈被不恰當(dāng)?shù)赜糜陴B(yǎng)雞場(chǎng)的清潔物品中，造成雞蛋被檢出殘留物。國(guó)內(nèi)也有些不法廠家為使獸藥達(dá)到迅速起效的目的，在獸藥產(chǎn)品中非法添加化學(xué)藥物，從而提高銷(xiāo)量來(lái)獲取更大利潤(rùn)?？紤]到非潑羅尼存在被非法添加的可能，從而給動(dòng)物源性食品安全埋下隱患，因此，急需建立一種方法以篩查其他獸藥中非法添加的非潑羅尼，為農(nóng)業(yè)農(nóng)村部嚴(yán)查違法使用氟蟲(chóng)腈提供技術(shù)支撐。本試驗(yàn)參考非潑羅尼含量測(cè)定相關(guān)檢測(cè)方法，并結(jié)合獸藥中非法添加檢測(cè)工作特點(diǎn)[4-8]，采用高效液相色譜法與二極管陣列檢測(cè)器，建立了阿維菌素粉、甲基吡啶磷可濕性粉、環(huán)丙氨嗪預(yù)混劑3種獸藥中非法添加非潑羅尼的HPLC-PDA檢測(cè)方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑 高效液相色譜儀-二極管陣列檢測(cè)器(Waters e2695 2998，Empower2色譜工作站軟件)；分析天平(梅特勒XS 205，十萬(wàn)分之一)；甲醇、乙腈為色譜純，水(超純水)。

1.2 試藥 非潑羅尼對(duì)照品(含量：98.5%，批號(hào)：GBW(E)061583 20170328，上海市農(nóng)藥研究所有限公司)；空白制劑：阿維菌素粉空白樣品(批號(hào)：20161205，規(guī)格：1%)、甲基吡啶磷可濕性粉空白樣品(批號(hào)：20170714，規(guī)格：50%)、環(huán)丙氨嗪預(yù)混劑空白樣品(批號(hào)：C807955，規(guī)格：10%)，經(jīng)檢測(cè)均不含非潑羅尼；供試品：阿維菌素粉陽(yáng)性樣品(自制，含2%的非潑羅尼)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以水為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；采用二極管陣列檢測(cè)器，采集波長(zhǎng)范圍為190 ～400 nm，分辨率為1.2 nm；記錄220 nm波長(zhǎng)處的色譜圖，同時(shí)記錄光譜圖。

表1 梯度洗脫條件Tab 1 Procedure of gradient elution

2.2 溶液配制

2.2.1 制劑空白溶液 取空白制劑1.0 g，置50 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理5 min，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；取5.0 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。

2.2.2 供試品溶液 取供試品1.0 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理5 min，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；取5.0 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。

2.2.3 非潑羅尼對(duì)照品儲(chǔ)備液 取非潑羅尼對(duì)照品50 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。

2.2.4 非潑羅尼對(duì)照品溶液 精密量取非潑羅尼對(duì)照品儲(chǔ)備液2 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；精密量取5 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。

2.2.5 檢測(cè)限溶液(0.25、0.5、1.0 g/kg) 取空白制劑1.0 g，置50 mL量瓶中，分別精密加入非潑羅尼對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5、1、2 mL，加甲醇適量，超聲處理5 min，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；精密量取5 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。

2.2.6 回收率試驗(yàn)溶液 取空白制劑1.0 g，置50 mL量瓶中，精密加入非潑羅尼對(duì)照品儲(chǔ)備液2 mL，加甲醇適量，超聲處理5 min，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；精密量取5 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。

2.2.7 建立光譜數(shù)據(jù)庫(kù)的溶液 以非潑羅尼對(duì)照品溶液作為建立光譜數(shù)據(jù)庫(kù)的溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專(zhuān)屬性 通過(guò)制劑空白試驗(yàn)和本底添加試驗(yàn)排除各制劑中主要成分與輔料對(duì)被測(cè)物的干擾。分別精密量取2.2.1項(xiàng)下制劑空白溶液、2.2.4項(xiàng)下非潑羅尼對(duì)照品溶液、2.2.6項(xiàng)下回收率試驗(yàn)溶液各10 μL，照2.1項(xiàng)下色譜條件，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖與光譜圖。結(jié)果顯示，非潑羅尼對(duì)照品的保留時(shí)間約為8.5 min，阿維菌素粉、甲基吡啶磷可濕性粉與環(huán)丙氨嗪預(yù)混劑的主成分的保留時(shí)間分別約為19.6、3.9、3.0 min，其輔料也不在非潑羅尼出峰處出峰(圖1～圖4)。此外，回收率試驗(yàn)溶液中非潑羅尼峰的純度角度均小于純度閾值(表2)，為單一物質(zhì)峰，表明該色譜條件下3種制劑本底均對(duì)非潑羅尼的測(cè)定無(wú)干擾。

2.3.2 檢測(cè)限 通過(guò)制劑空白添加被測(cè)物對(duì)照品來(lái)考察方法的檢測(cè)限。照2.2.5項(xiàng)下配制各制劑的檢測(cè)限溶液(0.25、0.5、1.0 g/kg)，精密量取10 μL進(jìn)行測(cè)定。綜合考慮色譜圖峰型、峰面積，以光譜圖失真的最大濃度作為方法的檢測(cè)限。結(jié)果顯示，3種制劑檢查非潑羅尼的檢測(cè)限均為0.5 g/kg。

2.3.3 準(zhǔn)確度 通過(guò)制劑空白添加被測(cè)物對(duì)照品做回收率試驗(yàn)來(lái)考察方法的準(zhǔn)確度。照2.2.6項(xiàng)下平行配制6份各制劑的回收率試驗(yàn)溶液，精密量取10 μL進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，阿維菌素粉、甲基吡啶磷可濕性粉與環(huán)丙氨嗪預(yù)混劑中非潑羅尼的回收率分別為100.0%(RSD=1.6%)、108.7%(RSD=1.1%)、109.3%(RSD=1.2%)。

圖1 阿維菌素粉空白溶液光譜色譜圖Fig 1 The chromatogram and spectrum of avermectin powder

圖2 甲基吡啶磷可濕性粉空白溶液光譜色譜圖Fig 2 The chromatogram and spectrum of azamethiphos wettable powder

圖3 環(huán)丙氨嗪預(yù)混劑空白溶液光譜色譜圖Fig 3 The chromatogram and spectrum of cyromazine premix

圖4 非潑羅尼對(duì)照品光譜色譜圖Fig 4 The chromatogram and spectrum of fipronil

藥物名稱保留時(shí)間/min純度角度純度閾值純度結(jié)果匹配角度匹配閾值匹配結(jié)果阿維菌素粉8.4781.7322.978單一物質(zhì)峰0.8632.063光譜相似甲基吡啶磷可濕性粉8.4961.6102.767單一物質(zhì)峰0.7491.917光譜相似環(huán)丙氨嗪預(yù)混劑8.4681.6592.742單一物質(zhì)峰0.6881.897光譜相似非潑羅尼對(duì)照品8.4761.7423.060單一物質(zhì)峰0.7212.039光譜相似

2.3.4 耐用性 以各制劑的回收率試驗(yàn)溶液作為耐用性試驗(yàn)溶液，從柱溫、流速、色譜柱三個(gè)方面考察非潑羅尼檢查方法的耐用性。調(diào)節(jié)柱溫分別為25、30、35 ℃，結(jié)果顯示：隨柱溫升高，非潑羅尼保留時(shí)間提前，分離度均符合要求；改變流速分別為0.9、1.0、1.1 mL/min，結(jié)果顯示：隨流速增大，非潑羅尼保留時(shí)間明顯提前，分離度均符合要求；選擇三款不同品牌色譜柱，Waters Atlantis T3 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、GRACE Alltima C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)和Agilent Extend C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，結(jié)果顯示：三款色譜柱僅保留時(shí)間不同，非潑羅尼峰與其他峰分離度均符合要求，理論板數(shù)均高于10000，拖尾因子均約為1.1。以上結(jié)果表明，本方法耐用性較好，能滿足非潑羅尼的檢查要求。

2.4 樣品測(cè)定 取阿維菌素粉陽(yáng)性樣品，照2.2.2項(xiàng)下配制供試品溶液，非潑羅尼對(duì)照品溶液的濃度調(diào)整為峰面積與供試品溶液相當(dāng)。分別精密量取10 μL，照2.1項(xiàng)下色譜條件，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖與光譜圖。結(jié)果顯示，供試品溶液在與非潑羅尼對(duì)照品保留時(shí)間一致處出峰；該色譜峰純度角度小于純度閾值，為單一物質(zhì)峰；將其光譜與非潑羅尼對(duì)照品的光譜匹配，匹配角度小于匹配閾值，說(shuō)明與非潑羅尼對(duì)照品的光譜相似，且兩者最大吸收波長(zhǎng)一致。以上結(jié)果表明樣品中檢出非潑羅尼(表3)。

表3 阿維菌素粉陽(yáng)性樣品檢查結(jié)果表Tab 3 The results of avermectin powder sample test

3 討 論

3.1 溶媒的選擇 非法添加檢查通常只需考慮被測(cè)物盡可能被提取并檢測(cè)到，而不需要考慮制劑自身主成分的溶解性，因此，根據(jù)非潑羅尼在甲醇或丙酮中易溶、在水中幾乎不溶的性質(zhì)，選擇甲醇作為溶媒。

3.2 流動(dòng)相系統(tǒng)的選擇 參考中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部第1938號(hào)、第2026號(hào)與第2138號(hào)公告中非潑羅尼含量測(cè)定的流動(dòng)相系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)多采用甲醇-乙腈-水體系，但是比例不同。當(dāng)乙腈比例小甚至不使用乙腈時(shí)，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)或?qū)⒘魉偬岣叩?.2 mL/min，或使用150 mm的短色譜柱來(lái)加快非潑羅尼的出峰，同時(shí)試驗(yàn)過(guò)程也發(fā)現(xiàn)，對(duì)于非潑羅尼來(lái)說(shuō)乙腈的洗脫能力明顯強(qiáng)于甲醇。考慮到操作的簡(jiǎn)便性及檢測(cè)的快速，有機(jī)相僅選取一種，采用乙腈-水作為流動(dòng)相。此外，為了擴(kuò)大方法的適用范圍，綜合考慮非潑羅尼的出峰時(shí)間不能太晚且與其他物質(zhì)能完全分離，以及使制劑中自身的主成分與輔料也能洗脫出來(lái)，采用了梯度洗脫的方式。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 采用二極管陣列檢測(cè)器，在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外吸收?qǐng)D譜掃描。非潑羅尼在200 nm和278 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，前者低于甲醇的截止使用波長(zhǎng)，后者的吸收度較低，參考中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部第1938號(hào)、第2026號(hào)與第2138號(hào)公告中非潑羅尼含量測(cè)定均采用220 nm進(jìn)行測(cè)定，該波長(zhǎng)正好位于光譜圖的肩縫處，且響應(yīng)也較高，故選擇220 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.4 保留時(shí)間、峰純度檢查與光譜相似度檢查 保留時(shí)間是否一致是判斷兩個(gè)色譜峰是否為同一化合物的初步依據(jù)，而峰純度檢查可以判斷色譜峰是否為單一物質(zhì)峰，光譜相似度檢查可以排除保留時(shí)間一致，但紫外光譜不同的化合物的干擾。在對(duì)3種制劑的回收率試驗(yàn)溶液和檢測(cè)限溶液的各項(xiàng)檢測(cè)中，在與非潑羅尼對(duì)照品溶液主峰保留時(shí)間一致處出峰，且純度角度均小于純度閾值，匹配角度均小于匹配閾值。表明在該液相條件下，可在3種制劑中檢出非潑羅尼，方法可行。

4 結(jié) 論

本方法建立了HPLC-PDA法檢測(cè)3種殺蟲(chóng)藥中非法添加非潑羅尼的檢查方法，綜合保留時(shí)間、最大吸收波長(zhǎng)、峰純度檢查和光譜相似度檢查四方面的信息，實(shí)現(xiàn)了獸藥中非法添加物的準(zhǔn)確識(shí)別。該方法操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高，為打擊獸藥制劑非法添加非潑羅尼制假行為提供了有力的技術(shù)支持。