程穎慧，王 穎，楊曉朱，章桂明，馮建軍，汪 瑩

（1.深圳市仙湖植物園，廣東 深圳 518000；2.深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東 深圳 518045；3.廣東生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院，廣東 廣州 510520）

咖啡漿果炭疽?。╟offee berry disease）是由Colletotrichum kahawaeJ. M. Waller et Bridge引起的咖啡上的一種毀滅性病害，病原菌屬于真菌界（Fungi）、無性型真菌（Anamorphic fungi）、炭疽菌屬（Colletotrichum），寄主主要有阿拉伯種咖啡（Coffea arabica）、甘弗拉種咖啡（C. canephora）、利比里亞種咖啡（C.liberica）。咖啡漿果炭疽病菌主要分布在安哥拉、布隆迪、喀麥隆、中非、剛果（布）、剛果（金）、埃塞俄比亞、肯尼亞、馬拉維、莫桑比克、盧旺達(dá)、坦桑尼亞、烏干達(dá)、贊比亞、津巴布韋、古巴等國家，嚴(yán)重影響這些國家咖啡種植業(yè)，造成的經(jīng)濟(jì)損失可達(dá)到60%，喀麥隆曾報(bào)道造成損失高達(dá)90%［1-2］。

炭疽菌屬在分類鑒定上，比較形態(tài)學(xué)及致病性測定等鑒定方法潛在問題很多，不論是比較形態(tài)學(xué)還是分子生物學(xué)手段，都不能很好地解決炭疽菌的分類難題［3］?；|(zhì)輔助激光解吸/電離（Matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI）技術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)上應(yīng)用較多，特別是細(xì)菌的分型鑒定中應(yīng)用較為廣泛且成熟，而在植物病原真菌分類、鑒定及檢測中的應(yīng)用則很少。在真菌鑒定方面，主要是用于鑒定酵母菌、酵母樣菌和絲狀真菌，如對曲霉、青霉、鐮刀菌等的分型鑒定上的應(yīng)有有一定的研究基礎(chǔ)［4-18］。近年來，該方法也與分子生物學(xué)方法結(jié)合，用于各種病原體的檢測和鑒定研究［19］。

本研究針對目前國內(nèi)外基于形態(tài)學(xué)特征、血清學(xué)、分子生物學(xué)方法對炭疽菌進(jìn)行檢測鑒定的局限性這一難題，首次采用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測方法對炭疽菌進(jìn)行分析，研究了影響MALDI TOFMS分析植物病原炭疽菌的重要實(shí)驗(yàn)因素，建立了MALDI TOFMS檢測炭疽菌的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法，構(gòu)建簡便、快速、高通量檢測技術(shù)平臺，為保障我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和貿(mào)易提供必要的檢疫技術(shù)手段，也為制定有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株：供試炭疽菌菌株共13株，分別 為Colletotrichum kahawae（LC0082）、C. coffeanum（CBS396.67）、C. acutatum（MYA4519）、C. fructicola（LC 0032）、C. fructicola（LC 0033）、C. siamense（LC0034）、C.asianum（LC0037）、C. hymenocallidis（LC 0039）、C. karstii（LC 0042）、C. gloeosporioides（LC 0081）、C. horii（LC 0218）、C. fragariae（LC 0220）、C. simmondsii（LC 0937），25 ℃下液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。其中LC編號的供試炭疽菌為模式菌株，由中科院微生物所蔡磊教授提供；MYA4519購自ATCC菌種保藏中心；CBS396.67購自CBS菌種保藏中心。

儀器：Bruker公司的MALDI microflex儀。

試劑：α-氰基-4-羥基肉桂酸（Alphacyano-4hydroxy-cinnamic acid，HCCA）， 芥 子酸（Sanipinic acid，SA），蝸牛消化酶（Snail digestive enzyme）；質(zhì)譜校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品；無水乙醇、瓊脂粉、葡萄糖，均為分析純。

基質(zhì)溶劑按乙腈∶三氟乙酸∶無菌去離子水（50%:2.5%:47.5%）的比例配置；稱量5 mg HCCA或SA溶于500 μL基質(zhì)溶劑中配置基質(zhì)溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 富集液體培養(yǎng)的菌絲，用無菌水充分洗兩次，離心后，留菌絲棄上清。取適量洗凈的菌絲體置于2 mL離心管中，再加入300～500 μL滅菌去離子水振蕩混勻，最后加入3倍體積的無水乙醇振蕩混勻，-20℃保存?zhèn)溆?。?20℃保存?zhèn)溆玫木z5 mg，高速離心（10 000～16 000 r/min）2 min，棄上清，必要時(shí)，再離心一次，盡量去除乙醇和水。加入50 μL溶劑[70%甲酸∶100%乙腈(1:1) ]，在有冰袋控溫的條件下超聲波處理10 min后，高速離心（10 000～16 000 r/min）2 min，取 1 μL 上清液點(diǎn)樣于MALDI TOF樣品板上，室溫下晾干，再點(diǎn)加1 μL基質(zhì)溶液覆蓋于樣品層上，室溫下晾干后上機(jī)檢測。

1.2.2 分析條件 MALDI-TOF-MS參數(shù)：離子源1：20.08 KV；離子源2：18.60 KV；延遲提取時(shí)間：340 ns（正離子檢測方式）；質(zhì)量范圍 m/z值：1 000～20 000 Da；激光能量：35%（Offset：15%，Range：30%）。采用大腸桿菌（E.coli） DH5 alpha standards，在 flexControl 中的calibration中對 m/z 4 364.33000、5 095.82000、6 254.39000、6 315.19000等進(jìn)行校正。

1.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 以LC0082樣品為材料，在同一個(gè)樣品板上重復(fù)點(diǎn)樣4 個(gè)，進(jìn)行MALDI分析，每個(gè)樣品點(diǎn)采集5張圖譜，共20 張圖譜，得到每張圖譜與20張圖譜合成的一張圖進(jìn)行比較，根據(jù)獲得的20 張圖譜的log(score)值衡量方法的重復(fù)性，如果log(score)值大于2，表明圖譜的重復(fù)性好。以LC0082在不同時(shí)間重復(fù)培養(yǎng)3次的樣品為材料，重復(fù)點(diǎn)樣4 個(gè)，進(jìn)行MALDI分析，每個(gè)樣品點(diǎn)采集5 張圖譜，然后進(jìn)行批與批之間的比較（即批1/批2、批1/批3、批2/批3），分別將兩批樣品的40 張圖譜合成一張圖放入數(shù)據(jù)庫，每批的20 張圖譜與合成的這張圖譜進(jìn)行比較，從而獲得每張圖譜的log(score)值，并得到批間的log(score)值。如果批間log(score)值大于2，表明重復(fù)培養(yǎng)的樣品重復(fù)性好。

2 結(jié)果與分析

2.1 咖啡漿果炭疽菌模式菌株檢測

采用標(biāo)準(zhǔn)方法對咖啡漿果炭疽模式菌株LC0082進(jìn)行MOLDI TOFMS檢測，獲得的特異性蛋白圖譜峰有9 個(gè)，分別為1 097.594、1 777.133、2 551.820、2 988.099、3 381.554、3 708.773、5 492.821、6 007.389、7 144.144、8 012.514（m/z），強(qiáng)度均在可用范圍（SNR＞2，信噪比Signal-to-noise ratio, SNR），結(jié)果見圖1。

圖1 咖啡漿果炭疽病菌模式種LC0082的結(jié)果圖譜

2.2 重復(fù)性試驗(yàn)

Biotyper軟件分析結(jié)果顯示，咖啡漿果炭疽病菌的每張圖譜與20張圖譜合成一張圖（圖2，封二）。通過比較獲得的log(score)值均大于2，說明試驗(yàn)重復(fù)性好。

對供試的咖啡漿果炭疽菌進(jìn)行3次重復(fù)培養(yǎng)獲得的MALDI TOFMS圖譜（圖3，封二）可知，3批結(jié)果的log(score)值均大于2，說明批間樣品的重復(fù)性較好。

2.3 方法適用性試驗(yàn)

供試的炭疽菌屬內(nèi)12種13個(gè)菌株（Colletotrichum kahawae、C. acutatum、C.coffeanum、C. fructicola、C. fructicola、C. siamense、C. asianum、C. hymenocallidis、C. karstii、C. gloeosporioides、C.horii、C. fragariae、C. simmondsii）的蛋白圖譜均互不相同，每個(gè)種都有各自的特有峰（圖4，封二），如C. kahawae的特有峰為1 097、1 777、2 551、2 988、3 381、3 708、5 492、6 007、7 144、8 012，C. acutatum的 特 有 峰 為 4 095、4 154、4 222、4 226、4 310、5 800、6 538、9 844、12 368。

炭疽菌屬中其余11個(gè)種12個(gè)菌株的圖譜分別與咖啡漿果炭疽菌模式菌株LC0082所構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行比較，log(score)值均在2以下，分別為0.639（CBS396.67）、0.506（MYA4519）、0.885（LC 0032）、0.774（LC 0033）、0.882（LC 0034）、1.196（LC 0037）、1.094（LC 0039）、0.495（LC 0042）、1.708（LC 0081）、1.091（LC 0218）、1.721（LC 0220）、1.005（LC 0937），表明該方法能實(shí)現(xiàn)炭疽菌屬不同種的鑒定。從圖4（封二）可以看出，LC0081與LC0220的比值比起其它菌株要高很多。

3 結(jié)論與討論

本研究獲得了炭疽菌12 個(gè)種13個(gè)菌株的標(biāo)準(zhǔn)圖譜，創(chuàng)建了炭疽菌蛋白質(zhì)譜指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫；首次建立了炭疽菌C.kahawae的MALDI TOFMS檢測方法，該方法快速、準(zhǔn)確、高通量、重復(fù)性好，能夠?qū)ν粯悠泛?次重復(fù)培養(yǎng)樣品獲得準(zhǔn)確、可靠、一致的結(jié)果。這種可靠的重現(xiàn)性是建立MALDI TOFMS指紋圖譜數(shù)據(jù)庫，經(jīng)圖譜庫檢索實(shí)現(xiàn)未知菌株鑒定的基礎(chǔ)；運(yùn)用本研究所搭建的MALDI TOFMS檢測平臺為其他真菌快速、微量、高通量及標(biāo)準(zhǔn)化檢測開辟了新的途徑，該技術(shù)在真菌學(xué)、植物檢疫領(lǐng)域具有十分廣闊的發(fā)展前景。

本研究建立了MALDI TOFMS分析炭疽菌的標(biāo)準(zhǔn)方法，該方法綜合考慮了MALDI TOFMS分析的各種影響因素包括前處理、基質(zhì)、基質(zhì)溶劑、樣品和基質(zhì)的比例、點(diǎn)樣方法等樣品前處理是影響整個(gè)分析的關(guān)鍵，是首要影響因子，是產(chǎn)生準(zhǔn)確性和可重復(fù)性數(shù)據(jù)的前提。樣品前處理主要是去除雜質(zhì)的影響和破除細(xì)胞壁的作用，以使更多的檢測成分得以釋放；而基質(zhì)的選擇主要從基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)以及和樣品之間的相互作用考慮，與待分析的樣品和使用其他試劑關(guān)系較大；基質(zhì)溶劑首先應(yīng)具有對樣品和基質(zhì)的共溶解能力，且不與基質(zhì)產(chǎn)生相互作用，并能提供合適的pH值，以利于樣品分子的電離；點(diǎn)樣方法主要影響結(jié)晶的均勻性及樣品和基質(zhì)之間形成的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，從而影響圖譜的重現(xiàn)性、信號的質(zhì)量和質(zhì)量范圍等。這些影響因素在 Amiri-Eliasi等［12］研究Saccharomyces cerevisiae、Welham等[20]分析Penicilliumspp.、Scytalidiumdimidiatum和Trichophytonrubrum、李鳳琴等［4］分析不同屬食品真菌、Riat等［14］分 析Aspergillusniger、Rhizopusoryzae、Trichodermaressei等的過程中均有提到。

本研究收集的炭疽菌中有11株是模式菌，模式種來源可靠，用來建立標(biāo)準(zhǔn)圖譜繼而建立標(biāo)準(zhǔn)圖譜鑒定數(shù)據(jù)庫，具有說服力和可靠性。

炭疽菌目前分類情況復(fù)雜，形態(tài)學(xué)鑒定需要經(jīng)驗(yàn)豐富的專家才有可能正確完成，且歷時(shí)長；而同工酶、血清學(xué)等方法也存在結(jié)果不穩(wěn)定、特異性不強(qiáng)等問題；分子生物學(xué)方法也存在操作復(fù)雜、假陽性、假陰性、登錄的公開序列有錯(cuò)誤的情況，因此分子生物學(xué)的鑒定也存在一定的問題。越來越多的學(xué)者認(rèn)為，對于復(fù)雜真菌的鑒定，需要綜合多種手段全面考慮，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。MALDI TOFMS分析過程簡單、快速，不需進(jìn)行DNA提取、序列測定和分析、特異引物的設(shè)計(jì)、條件篩選及靈敏度實(shí)驗(yàn)等，只需要微量菌絲（2 mg）不需產(chǎn)生孢子就可實(shí)現(xiàn)鑒定，幾分鐘就可以完成一個(gè)樣品分析，每個(gè)樣品的自動(dòng)圖譜可以在幾秒鐘內(nèi)完成，一個(gè)完整的數(shù)據(jù)又可以放進(jìn)鑒定軟件里進(jìn)行分析。另外，MALDI TOFMS具有高通量的優(yōu)點(diǎn)：一個(gè)樣品靶同時(shí)一次性點(diǎn)樣96個(gè)，一次性可以檢測96個(gè)目標(biāo)樣品，幾分鐘內(nèi)同時(shí)完成鑒定，大大縮短檢測時(shí)間，提高檢測效率，因此MALDI TOFMS技術(shù)在其研究上有廣闊的前景。

采用MALDI TOFMS分析炭疽菌屬內(nèi)不同種，通過對模式菌株的重復(fù)試驗(yàn)得到蛋白質(zhì)特異信號峰，成功找到區(qū)分的信號峰，實(shí)現(xiàn)炭疽菌不同種菌株的成功鑒定，建立了MALDI TOFMS分析炭疽菌的檢測方法，該方法快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好、高通量、對樣品要求的純度不高，能耐受一定量的小分子如鹽、去污劑等，具有較高的檢測范圍。同時(shí)，該方法所需要的樣品量少，即使樣品的量和濃度很低，通過儀器和信號的累加功能同樣可以獲得一張高分辨率和高質(zhì)量的質(zhì)譜圖，對于炭疽菌的鑒定檢測是一種非常好的方法。

該方法在真菌檢測方面也存在一定的局限性。例如，真菌常表現(xiàn)出完全不同的表型，蛋白圖譜可能和生長條件有關(guān)，需要進(jìn)一步深入分析；需要嚴(yán)格控制培養(yǎng)條件，有報(bào)道指出菌絲、孢子以及菌絲和孢子混合的蛋白圖譜有可能不同；固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)方式對檢測結(jié)果也有一定影響，有報(bào)道指出液體培養(yǎng)基搖出來的菌比固體培養(yǎng)的菌會(huì)得到更多的峰，重復(fù)性更好；培養(yǎng)基的種類也可能存在影響；蛋白的提取需要標(biāo)準(zhǔn)化才能進(jìn)行推廣應(yīng)用，否則有可能得到完全不同的圖譜而造成鑒定上的錯(cuò)誤。目前真菌的數(shù)據(jù)庫內(nèi)容非常缺乏，特別是植物病原真菌的蛋白數(shù)據(jù)庫，因此需要進(jìn)行大量的基礎(chǔ)研究充實(shí)真菌鑒定數(shù)據(jù)庫。本研究充分考慮到以上局限性，在培養(yǎng)條件、蛋白提取等實(shí)驗(yàn)前處理步驟進(jìn)行了嚴(yán)格控制，所有操作均在一致條件下進(jìn)行，確保結(jié)果可靠性，試驗(yàn)結(jié)果也證明了本研究的重復(fù)性。

圖2 咖啡漿果炭疽病菌同一樣品4個(gè)樣品點(diǎn)的20張圖譜

圖3 3批咖啡漿果炭疽病菌樣品的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

圖4 啡漿果炭疽菌、尖孢炭疽菌及炭疽菌其他種的MALDI TOF MS圖譜