李美方芳李小寧

(皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院檢驗(yàn)科,安徽蕪湖241001)

乙型肝炎病毒造成了嚴(yán)重的全球衛(wèi)生問題,世界上三分之一的人口感染了這種病毒,其中3.7億是慢性攜帶者,每年大約有100萬人死于HBV感染相關(guān)的肝衰竭、肝硬化、原發(fā)性肝癌等[1]。病毒血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)可輔助臨床早期診斷乙型肝炎,從而早期給予針對(duì)性治療,利于疾病的康復(fù)[2]。隨著醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)的不斷發(fā)展,檢測(cè)乙型肝炎病毒 (HBV)標(biāo)志物的方法不斷更新,目前主要有酶聯(lián)免疫吸附法 (ELISA)、固相放射免疫法、膠體金免疫層析法、時(shí)間分辨免疫熒光法、微粒子酶免疫分析法、化學(xué)發(fā)光法及電化學(xué)發(fā)光法(ECLIA)等[3]。其中ECLIA是結(jié)合生物素及鏈霉親和素參與反應(yīng)的方法,將釕作為標(biāo)記物,通過測(cè)定光電信號(hào)對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定,敏感度顯著提高[4]。研究發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)前因素 (如標(biāo)本采集和運(yùn)送、標(biāo)本放置時(shí)間與溫度、標(biāo)本離心溫度與轉(zhuǎn)數(shù)、抗凝劑的種類及比例等)已成為影響檢測(cè)結(jié)果的主要因素[5]。因此,研究ECLIA的實(shí)驗(yàn)前因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響,尤其是真菌和細(xì)菌對(duì)ECLIA法檢測(cè)結(jié)果的影響就顯得尤為重要,并且國內(nèi)外目前尚無相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)就是采用ECLIA測(cè)定HB-sAg、HBeAg和HBcAb,探討白色假絲酵母菌和表皮葡萄球菌是否影響電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)乙型肝炎的結(jié)果,旨在提高檢驗(yàn)質(zhì)量保證結(jié)果準(zhǔn)確,從而為臨床的診斷和治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院2017年2至3月份門診或者住院經(jīng)臨床診斷確診為乙型肝炎大三陽患者的血液標(biāo)本共48例。納入標(biāo)準(zhǔn)：近1個(gè)月內(nèi)無炎癥、感染、菌血癥病史的成年男性患者29例和女性患者19例,平均年齡35歲。

1.2 儀器與試劑

儀器電熱恒溫水槽DK-600型 (上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司),二氧化碳培養(yǎng)箱 (上海力申科學(xué)儀器有限公司),Roche cobas 8000系列電化學(xué)自動(dòng)分析儀cobase 602(德國羅氏)。試劑乙型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg)、e抗原 (HBeAg)、核心抗體 (HBcAb)檢測(cè)試劑盒均來自羅氏診斷產(chǎn)品 (上海)有限公司。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 標(biāo)本采集 空腹抽取靜脈血5 mL,避免溶血和脂血。靜置30 min,4 000 r/min離心5 min,及時(shí)分離血清,-20℃密閉保存。

1.3.2 血清標(biāo)志物檢測(cè) 將冷凍標(biāo)本放置37℃電熱恒溫水槽中解凍,室溫下每一例標(biāo)本均設(shè)立1個(gè)對(duì)照組和6個(gè)實(shí)驗(yàn)組,對(duì)照組是加入200 μL血清和200 μL生理鹽水,實(shí)驗(yàn)組是每組加入200 μL血清后,再分別依次分別加入200 μL 0.5、2.0、3.0 MCF的白色假絲酵母菌和0.5、2.0、3.0 MCF的表皮葡萄球菌,混勻,然后用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)標(biāo)本的信號(hào)。實(shí)驗(yàn)前校正好儀器,機(jī)器運(yùn)行狀態(tài)良好,所有操作及判斷結(jié)果均嚴(yán)格按照儀器及試劑盒說明書進(jìn)行,質(zhì)控和樣本準(zhǔn)確性和精密性均符合標(biāo)準(zhǔn)要求。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS18.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)計(jì)量資料行方差齊性檢測(cè)后,多組之間對(duì)比采用單因素方差分析,兩兩之間對(duì)比采用LSD-T檢驗(yàn)比較用行,計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法對(duì)比分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度的白色念珠菌對(duì)HBsAg、HBeAg、HBcAb測(cè)量結(jié)果的比較

結(jié)果顯示0.5、2.0、3.0 MCF白色假絲酵母菌分別與對(duì)照組相比,HBsAg、HBcAb檢測(cè)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05),而HBeAg的結(jié)果比較無差異 (P＞0.05)。并且不同濃度的白色念珠菌組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明白色念珠菌會(huì)影響HBsAg、HBcAb的檢測(cè)結(jié)果,但與菌液濃度無關(guān),且白色念珠菌不影響HBeAg的檢測(cè)結(jié)果,見表1。

表1 不同濃度的白色假絲酵母菌對(duì)HBsAg、HBeAg、HBcAb測(cè)量結(jié)果的比較

2.2 不同濃度的表皮葡萄球菌對(duì)HBsAg、HBeAg、HBcAb測(cè)量結(jié)果的比較

結(jié)果顯示0.5、2.0、3.0 MCF表皮葡萄球菌組分別與對(duì)照組相比,HBsAg、HBeAg、HBcAb檢測(cè)結(jié)果無差異 (P＞0.05),并且不同濃度的表皮葡萄球菌組之間也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說明表皮葡萄球菌不會(huì)影響HBsAg、HBeAg、HBcAb的檢測(cè)結(jié)果,見表2。

表2 不同濃度的表皮葡萄球菌對(duì)HBsAg、HBeAg、HBcAb測(cè)量結(jié)果的比較

3 討 論

3.1 研究的背景及意義

乙型肝炎血清學(xué)標(biāo)志物是臨床診斷乙型肝炎、判斷病毒復(fù)制情況的特異性指標(biāo),其主要用于乙型肝炎感染者的動(dòng)態(tài)療效觀察和病情監(jiān)測(cè)。因此,尋求檢測(cè)乙型肝炎血清學(xué)標(biāo)志物的靈敏性和特異性好的實(shí)驗(yàn)方法就顯得尤為重要,為早期診斷乙型肝炎及時(shí)抗病毒治療,延緩進(jìn)展為肝硬化甚至原發(fā)性肝癌具有重要臨床意義。

電化學(xué)發(fā)光法 (ECLIA)是新一代標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù),不使用放射性物質(zhì),具有高靈敏度、高特異性、重復(fù)性好、線性寬、反應(yīng)快速、影響因素少、結(jié)果準(zhǔn)確、自動(dòng)化檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn),近年來已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué),特別是臨床醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域,從而提高了臨床醫(yī)學(xué)的診斷水平[6]。本實(shí)驗(yàn)采用ELCIA法檢測(cè)乙型肝炎大三陽患者的標(biāo)本 (HBsAg+、HBeAg+、HBcAb+),其中乙肝表面抗原 (HBsAg)是乙肝病毒的外殼蛋白,自身不帶有傳染性,但乙肝表面抗原陽性標(biāo)志著乙肝的發(fā)生;乙肝e抗原(HBeAg)陽性,說明乙肝病毒正在體內(nèi)復(fù)制,且傳染性較強(qiáng);乙肝核心抗體 (HBcAb)低滴度表明曾感染過乙肝病毒,高滴度表明乙肝病毒正活躍復(fù)制[7]。

3.2 實(shí)驗(yàn)室干擾乙肝兩對(duì)半結(jié)果的影響因素

如何控制實(shí)驗(yàn)過程中的影響因素,尤其是實(shí)驗(yàn)前的影響因素是檢驗(yàn)工作人員必須要重視的現(xiàn)實(shí)課題,也是檢驗(yàn)質(zhì)量和結(jié)果準(zhǔn)確的基本保證。因此乙肝兩對(duì)半的檢驗(yàn)工作者本著嚴(yán)謹(jǐn)負(fù)責(zé)的態(tài)度,就必須要注意到從樣本采集、試劑儀器及操作因素等每個(gè)流程對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室與臨床之間的溝通或轉(zhuǎn)至有條件醫(yī)院進(jìn)行確診,提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性[8]。目前檢驗(yàn)科血清標(biāo)本的保存時(shí)間及方法尚無統(tǒng)一規(guī)定,很多醫(yī)院是將分離血清標(biāo)本置4℃冰箱保存,集中檢測(cè)。由于自然環(huán)境中到處都有表皮葡萄球菌和白色假絲酵母菌等病原體的存在,從而會(huì)導(dǎo)致保存的標(biāo)本或質(zhì)控品容易被這些細(xì)菌或真菌的污染。

3.3 創(chuàng)新點(diǎn)及實(shí)際意義

本課題就是探討白色假絲酵母菌和表皮葡萄球菌對(duì)電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)乙型肝炎結(jié)果的影響,旨在提高檢驗(yàn)質(zhì)量保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性等方面具有重要臨床意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示加入白色假絲酵母菌的血清HBsAg,HBcAb的結(jié)果發(fā)生明顯變化 (P＜0.05),而加入表皮葡萄球菌的血清標(biāo)本結(jié)果穩(wěn)定(P＞0.05),HBeAg的結(jié)果均未受到白色假絲酵母菌和表皮葡萄球菌的影響,說明可能是由于白色假絲酵母菌和表皮葡萄球菌細(xì)胞壁所特有的不同成分或分泌的酶或代謝產(chǎn)物不同導(dǎo)致檢驗(yàn)結(jié)果的不同,具體原因不明,有待進(jìn)一步研究。郭仁勇等[9]的文獻(xiàn)報(bào)道不同乙型肝炎狀態(tài)的患者腸道真菌菌群多樣性較強(qiáng),其優(yōu)勢(shì)真菌菌屬為念珠菌屬和酵母菌屬,在研究中還發(fā)現(xiàn)念珠菌屬和曲霉菌屬是在人類胃腸道中與真菌感染密切相關(guān)的內(nèi)源性菌群。在免疫功能低下時(shí),大量服用抗菌藥物等情況下會(huì)引起侵襲性真菌感染。近年來侵襲性真菌感染發(fā)病率不斷增高,其中侵襲性念珠菌病和侵襲性曲霉病最常見。結(jié)合本研究的結(jié)果顯示電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)乙型肝炎病毒可能會(huì)受到白色假絲酵母菌的干擾,影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性,從而提示了臨床或檢驗(yàn)科醫(yī)師要及時(shí)檢測(cè)血清標(biāo)本,防止白色假絲酵母菌的污染。尤其要特別提示臨床醫(yī)生要重視可能有真菌感染的乙型肝炎患者,因患者易并發(fā)腸道的白色假絲酵母菌感染,由于白色假絲酵母菌所特有的細(xì)胞成分、分泌的酶或產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物,可能會(huì)產(chǎn)生假陽性或假陰性的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果,從而干擾甚至誤導(dǎo)臨床醫(yī)生的診斷和治療。

4 小 結(jié)

檢驗(yàn)工作者應(yīng)加強(qiáng)臨床與實(shí)驗(yàn)室之間的溝通或轉(zhuǎn)至上級(jí)醫(yī)院進(jìn)行確診,提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。總之,檢驗(yàn)醫(yī)師在選擇方法進(jìn)行檢測(cè)時(shí),一定要重視所有的干擾因素,從而保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和精密性,確保檢測(cè)結(jié)果的可靠性,為臨床提供真實(shí)可靠的檢驗(yàn)數(shù)據(jù),保證臨床診斷的準(zhǔn)確性。