張慧娟，張 伶，胡 蓉，江麗霞，鐘田雨

對于中小城市的科研實驗室來說，科研經(jīng)費嚴(yán)重不足，科研設(shè)備不齊全。一旦涉及基礎(chǔ)研究如載體構(gòu)建，科研人員只有去花一筆不菲的費用去公司購買載體。該研究采用低成本的磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑進行逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝，并用病毒原液成功感染懸浮細胞—KG-1a白血病細胞，大大節(jié)省了科研費用，同時解決懸浮細胞難轉(zhuǎn)染的問題，對于在一般科研條件下做基礎(chǔ)研究的科研人員，具有很大的參考價值。

1 材料與方法

1.1主要試劑磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑的配制：2 mol/L CaCl2(將29.4 g CaCl2溶于100 ml水，過濾后備用)和2×HBSS(將3.273 g NaCl2、0.149 g KCl、0.043 g Na2HPO4、0.43 g無水葡萄糖、2.338 g HEPES溶于180 ml的水，平均分至2瓶，分別調(diào)節(jié)pH至6.95和7.05，加水至100 ml，過濾后備用)。磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑、polybrene和嘌呤霉素均購自美國Sigma公司；RPMI 1640培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國Hyclone公司。

1.2質(zhì)粒、菌種和細胞培養(yǎng)MSCV-PIG(攜帶綠色熒光蛋白GFP)、Gag-pol、VSVG逆轉(zhuǎn)錄病毒載體由美國安德森實驗室惠贈，pSES-HUS(攜帶紅色熒光蛋白RFP)質(zhì)粒、逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞293T細胞、人白血病細胞株KG-1a由贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院科研中心保存。在37 ℃、5% CO2的條件下用含10%的胎牛血清，青霉素(100 U/ml)、鏈霉素(100 U/ml)和L-谷氨酰胺(2 mol/L)的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)293T細胞，RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)KG-1a細胞。

1.3磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑最佳pH值選擇將pSES-HUS 轉(zhuǎn)染入293T細胞，將pH為6.95和pH為7.05的HBSS按1 ∶9、2 ∶8、3 ∶7……10 ∶0各配1 ml，轉(zhuǎn)染時應(yīng)用各種配比的HBSS，轉(zhuǎn)染48 h后鏡下觀察細胞紅色熒光表達強弱。

1.4逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝

1.4.1轉(zhuǎn)染 準(zhǔn)備好兩個EP管：A管和B管。A管加入CaCl262.5 μl、MSCV-PIG 10 μg、Gag-pol 7.5 μg和VSVG 2.5 μg，振蕩混勻。B 管為500 μl最佳pH的HBSS溶液。將B液加入A管：A管放在振蕩器上，左手拿住A管的上端，右手將B液一滴一滴加入A管，該過程要持續(xù)1～2 min。加完樣之后，會有細小的白色沉淀出現(xiàn)，靜置30 min。將長在10 cm平皿融合度達60%的293T細胞去上清液，加入8 ml 高糖DMEM。將1 ml CaCl2-DNA-HBSS混合液均勻地一滴一滴滴入平皿, 輕輕混勻，放37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育。6～8 h后換普通培養(yǎng)基。

1.4.2病毒原液收集和感染KG-1a細胞 轉(zhuǎn)染48 h后收集293T細胞上清液，立即在平皿里加入10 ml DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)293T細胞。病毒原液常溫800 r/min離心5 min，用0.45 μm濾器過濾上清液以除去細胞碎片。再加入2 ml新鮮DMEM培養(yǎng)基，加入12 μl的polybrene，使polybrene終濃度為4 g/L，混勻。加入含KG-1a細胞的6孔板，2 ml/孔。用膠條封板，22 ℃、1 800 r/min，離心45 min后放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱。轉(zhuǎn)染72 h后第二次收集病毒上清液，再次感染KG-1a細胞，步驟同上。

圖1 不同pH值的HBSS溶液轉(zhuǎn)染293T細胞后48 h熒光圖和白光圖 ×400

A、 F：pH 6.95與pH 7.05的HBSS溶液體積比為6 ∶4轉(zhuǎn)染293T細胞后48 h熒光圖和白光圖；B、G：體積比為7 ∶3時的熒光圖和白光圖；C、H：體積比為8 ∶2時的熒光圖和白光圖；D、I：體積比為9 ∶1時的熒光圖和白光圖；E、J：體積比為10 ∶0時的熒光圖和白光圖

1.5KG-1a細胞穩(wěn)篩病毒感染細胞3 d后，用含嘌呤霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基換液，嘌呤霉素終濃度為2 g/L。穩(wěn)篩出靶細胞后，將嘌呤霉素終濃度每2 d從2 g/L依次降為1.5、1、0.5、0 g/L。

2 結(jié)果

2.1獲取磷酸鈣轉(zhuǎn)染法中HBSS溶液的最佳pH磷酸鈣轉(zhuǎn)染法中HBSS溶液的pH對轉(zhuǎn)染效率有非常大的影響，為了獲取最佳pH，本研究將pH 6.95和pH 7.05的HBSS溶液按不同比例混合，將攜帶紅色熒光的pSES-HUS質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細胞，結(jié)果顯示在pH 6.95與pH 7.05的HBSS溶液體積比在6 ∶4、7 ∶3、8 ∶2、9 ∶1和10 ∶0時鏡下觀察到明顯的紅色熒光，且pH 6.95與pH 7.05的HBSS溶液體積比值為8 ∶2時熒光最多，轉(zhuǎn)染效率約為40%，表明此時為最佳轉(zhuǎn)染pH。見圖1。因此，將以此pH的HBSS做后續(xù)實驗。

2.2逆轉(zhuǎn)錄病毒感染KG-1a細胞48h后熒光效率磷酸鈣法將MSCV-PIG、Gag-pol和VSVG 逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入293T細胞，轉(zhuǎn)染48 h和72 h后分別收集病毒原液感染KG-1a細胞。感染48 h后KG-1a細胞熒光比較稀少和微弱，熒光感染效率約為10%，見圖2。

2.3藥物穩(wěn)篩KG-1a細胞后的熒光效率逆轉(zhuǎn)錄病毒感染KG-1a細胞3 d后，加入2 g/L 嘌呤霉素進行穩(wěn)篩，攜帶有MSCV-PIG逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的KG-1a細胞具有抗嘌呤霉素抗性，能在藥物篩選中存活。藥物篩選后KG-1a細胞熒光增多，熒光變亮，其感染效率大于85%。見圖3。

圖2 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染KG-1a細胞后48 h熒光圖和白光圖 ×400

A：逆轉(zhuǎn)錄病毒感染KG-1a細胞后48 h熒光圖；B：逆轉(zhuǎn)錄病毒感染KG-1a細胞后48 h白光圖

圖3 嘌呤霉素篩選KG-1a細胞 ×400

A：加入2 g/L 嘌呤霉素篩選KG-1a細胞熒光圖；B：加入2 g/L 嘌呤霉素篩選KG-1a細胞白光圖

2.4病毒感染靶細胞中需要注意的問題Polybrene過量會殺死靶細胞，當(dāng)加入8 g/L polybrene時，KG-1a細胞出現(xiàn)皺縮，胞內(nèi)有細胞碎片，見圖4A箭頭所示；嘌呤霉素過量也會殺死靶細胞，當(dāng)加入4 g/L嘌呤霉素時，細胞膜完全破碎，細胞碎片分散，只留下細胞影，見圖4B箭頭所示。

3 討論

目前，基因干擾或過表達已經(jīng)成為實驗室研究基因功能的常規(guī)手段。無論是干擾或過表達，都需要質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或病毒感染靶細胞。對于懸浮細胞，尤其是白血病細胞株，用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或腺病毒感染，其轉(zhuǎn)染或感染效率都非常低，只有用逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒感染效果好。本研究通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法獲取逆轉(zhuǎn)錄病毒，采用病毒原液感染白血病細胞，并做穩(wěn)篩，獲取高感染率的目的細胞，在降低實驗成本的同時也解決了懸浮細胞難轉(zhuǎn)染的問題，為后續(xù)的實驗研究奠定基礎(chǔ)。

圖4 polybrene或嘌呤霉素過量對KG-1a細胞的影響 ×400

A：加入8 g/L polybrene對KG-1a細胞的影響；B：加入4 g/L嘌呤霉素對KG-1a細胞的影響

磷酸鈣轉(zhuǎn)染法與常用的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法相比，經(jīng)濟實惠，價格低廉，適合進行大規(guī)模的病毒包裝，但是，要獲得高效穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染效率仍舊是實驗研究中要面臨的難題[1]。影響磷酸鈣法轉(zhuǎn)染效率的兩個關(guān)鍵點是HBSS的pH值和形成的磷酸鈣顆粒大小。本研究將不同體積比的pH 6.95和pH 7.05的HBSS溶液混合，結(jié)果顯示只有在8 ∶2時293T細胞熒光最多，轉(zhuǎn)染效率最高，而在其他比例如0 ∶9、1 ∶8中，紅色熒光稀少?？梢?，在極小范圍內(nèi)改變pH值，可以極大地影響轉(zhuǎn)染效率。這也可能是在實驗中為何使用商品化的磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑，總是轉(zhuǎn)染效果不佳的原因。另外一個影響磷酸鈣法轉(zhuǎn)染效率的是磷酸鈣顆粒大小。有研究[2]表明形成1～3 μm大小的磷酸鈣顆粒對提高磷酸鈣法轉(zhuǎn)染效率非常關(guān)鍵。本研究是將HBSS溶液逐滴地加入在振蕩中的CaCl2-DNA混合物中，隨后靜置30 min，這樣才能形成最佳大小的磷酸鈣沉淀。漩渦振蕩的時間長短會影響轉(zhuǎn)染效率[3]。

逆轉(zhuǎn)錄病毒液離心過濾后，與6孔板內(nèi)KG-1a細胞共孵育，同時加入polybrene。采用旋轉(zhuǎn)法在22 ℃、1 800 r/min離心45 min，可以加大病毒顆粒與KG-1a細胞的接觸面，增加病毒感染效率。Polybrene是一種多聚陽離子聚合物，廣泛用于病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染，有助于提高病毒感染效果[4-5]。其作用機制可能是通過中和細胞表面唾液酸與病毒顆粒之間的靜電排斥從而促進吸附作用。研究[6]報道，與用病毒原液比較，采用病毒濃縮液細胞感染效率可大大提高。但是，病毒濃縮提純需要超速離心或購買商品化的純化柱純化。對于中小城市的實驗室，一般并不具備進行病毒濃縮的超速離心機，而購買純化柱純化，太過昂貴。本研究采用未經(jīng)濃縮的病毒原液感染白血病KG-1a細胞，其感染率確實低，只有10%左右。但是，經(jīng)過嘌呤霉素穩(wěn)篩，攜帶病毒載體的靶細胞陽性率可以高達85%，完全滿足后續(xù)的實驗研究。

在病毒感染靶細胞過程中，還需要注意：polybrene過量或嘌呤霉素過量都可能殺死靶細胞。因此，在實驗時，最好先做預(yù)實驗篩選出最佳的藥物濃度，既不損傷細胞又可獲得最佳的感染效率。此外，還有許多實驗細節(jié)需要注意：轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的量要足夠多，以保證后面包裝出足夠量的病毒感染靶細胞；嘌呤霉素穩(wěn)篩出靶細胞后，進行藥物撤離時，必須逐漸降低藥物濃度，而不能立刻將藥物濃度降為零，否則，靶細胞非常容易死亡。

本研究采用價格低廉的磷酸鈣轉(zhuǎn)染法進行病毒包裝。創(chuàng)新之處在于用旋轉(zhuǎn)離心法將病毒和靶細胞共孵育，采用未經(jīng)濃縮的病毒原液感染難轉(zhuǎn)染的白血病細胞，并通過藥物成功地穩(wěn)篩出陽性細胞株，保證后續(xù)研究。這對于需要做基礎(chǔ)研究但科研條件一般的實驗室來說，具有重要的借鑒價值。