任道援 張祖文 吳京春 覃宇 冉夢婷

紅曲菌（Monascus sp.）能夠產(chǎn)生紅曲色素、Monacolin類化合物、γ-氨基丁酸、酯酶等代謝物，故其在我國的食品行業(yè)、中醫(yī)藥行業(yè)中有悠久的應用歷史和廣泛用途。在醬香白酒發(fā)酵中，紅曲菌是霉菌類微生物的主體之一通過其一級代謝物酯化酶的作用，在釀酒過程中有產(chǎn)酒產(chǎn)香功能，有利于醬香型白酒風味物質(zhì)的形成，其在白酒釀造中仍有巨大的應用價值。

本文從對醬香型白酒大曲、酒糟和濃香型白酒大曲中分離的紅曲菌菌株，進行了酯酶同工酶酶譜分析，為當?shù)丶t曲菌微生物資源的保護和利用的進行了有益探索。

材料與方法

供試菌株。從貴州仁懷某酒廠提供的醬香型白酒大曲及酒糟及四川宜賓某酒廠提供濃香型白酒大曲中分離鑒定了19株紅曲菌。采用中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心購買紅曲霉標準菌株3株、和實驗室留存菌株3株作為對照。

主要儀器。恒溫水浴搖床，超凈工作臺，冷凍離心機，蛋白質(zhì)電泳儀。

酯酶同工酶電泳。將供試紅曲菌株經(jīng)過增殖、收集菌體研磨，加入磷酸緩沖液并離心收集上清液備用。參照NY/T 1097- 2006的方法，分離膠濃度7%，濃縮膠濃度5%。電泳條件為穩(wěn)流電泳，采用穩(wěn)流電流，電流為1.5 mA/cm，待指示液進入分離膠后調(diào)整電流為2.5 mA/cm。停止電泳后以α、β-醋酸萘酯和固藍RR鹽染色，7%的醋酸溶液固定。

數(shù)據(jù)處理。按同工酶酶譜中同一位點條帶的有無建立矩陣。采用NTSYS- 2.0軟件，以UPGMA聚類法進行聚類分析。

結果與討論

紅曲菌酯酶同工酶酶譜。對酯酶同工酶電泳條件基本一致的情況下，經(jīng)過多次電泳所得電泳譜帶重復性基本相同。如圖1所示。

由圖2可知，供試的25個菌株的酯酶同工酶酶譜具有多樣性，表現(xiàn)出9種不同的表型，基本可以區(qū)分不同的菌種。各菌株可分辨的酶帶為1～6條，共有16個不同的帶位，遷移率范圍為0.26～0.57。

經(jīng)形態(tài)學初步鑒定為紫色紅曲菌的酯酶同工酶酶譜分為了6種不同的表型，而其中M11、M4的酶譜與其余表型有明顯區(qū)別，可能屬于另外一個種。形態(tài)學初步鑒定為煙色紅曲菌的酯酶同工酶酶譜共出現(xiàn)3種不同的表型，且三種表型比較相近，可能為同一種的不同亞種，初步鑒定為紅色紅曲菌的菌株MR1與標準菌株531同工酶表型相近。

聚類分析。利用NTSYS- 2.0軟件包對25個菌株的同工酶譜帶矩陣數(shù)據(jù)進行UPGMA聚類分析，并構建樹狀圖（見圖2）。

在相似水平55%處，供試菌株劃分為2個明顯不同的類群：Ⅰ類為經(jīng)形態(tài)鑒定為紫色紅曲菌的類群（M5～M9），Ⅱ類為經(jīng)形態(tài)鑒定為煙色紅曲菌的類群（Q5～MY8）及經(jīng)形態(tài)鑒定為紅色紅曲菌的類群（MY3～MR1）。在相似水平77%處，供試菌株可劃分為5個群。I類紫色紅曲菌可進一步分為3類。II類煙色及紅色紅曲菌可劃分為單獨的2類。這與形態(tài)鑒定結果基本一致。

（1）不同來源的紅曲菌株所產(chǎn)酯酶多樣性豐富，不同種類菌株之間有明顯差異，表示菌株間產(chǎn)酯酶特性的差異，這為紅曲菌及其酶制劑在醬香型/濃香型白酒發(fā)酵中的深入研究提供的基礎。（2）依據(jù)酯酶同工酶電泳酶譜，對不同來源菌株的相似度進行聚類分析，其結果與形態(tài)鑒定結果基本一致，能夠為紅曲菌的鑒定提供參考。

基金項目：貴州省科技計劃項目（黔科合平臺人才[2016]5243- 02號）