溫海楠，謝守軍，陳東科，趙建宏

(1 承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北 承德 067000； 2 北京醫(yī)院，北京 100000； 3 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，河北 石家莊 050000)

牙周梭桿菌(Fusobacteriumperiodonticum)由Slots等[1]在1983年首次從口腔分離并確定其種屬，由其引起的血流感染較為罕見，目前國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道。2015年某院收治了1例血液病合并敗血癥的患者，其血液中分離出牙周梭桿菌。微生物室工作人員對(duì)于此類血液中分離的少見菌，高度警惕，使用不同檢驗(yàn)技術(shù)、檢測(cè)方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，現(xiàn)對(duì)此進(jìn)行報(bào)告，以期為臨床醫(yī)生了解其致病特點(diǎn)并盡早對(duì)患者進(jìn)行診治提供依據(jù)。

1 病歷資料

1.1 病史 患者女性，61歲，7天前出現(xiàn)發(fā)熱，體溫最高39.7℃，伴有發(fā)冷，無(wú)寒戰(zhàn)，自行口服“對(duì)乙酰氨基酚500 mg”后體溫可降至正常。5天前再次出現(xiàn)發(fā)熱，伴有口腔疼痛，自行口服“對(duì)乙酰氨基酚(具體不詳)”后體溫下降不明顯。4天前出現(xiàn)齒齦出血，伴鼻衄，經(jīng)檢查后以“真性紅細(xì)胞增多癥、粒細(xì)胞缺乏癥、口腔感染”于2015年7月14日入該院血液內(nèi)科。既往真性紅細(xì)胞增多癥1年，“高血壓病”病史2年，右側(cè)基底節(jié)區(qū)腦內(nèi)血腫微創(chuàng)清除術(shù)后9個(gè)月。

1.2 入院后檢查 入院體格檢查：體溫38.6℃，心率110次/分，呼吸20次/分，血壓140/80 mmHg，神清，精神差，右腕部皮膚可見瘀斑，淺表淋巴結(jié)未觸及腫大。齒齦紅腫滲血，咽無(wú)充血，扁桃體無(wú)腫大，胸骨無(wú)壓痛。雙肺呼吸音清，未聞及干、濕性啰音。心律齊，各瓣膜未聞及病理性雜音。腹部柔軟，無(wú)壓痛，肝肋下未觸及，脾肋下7 cm可觸及，質(zhì)硬，無(wú)觸痛。病理征陰性。

1.3 實(shí)驗(yàn)室檢查 白細(xì)胞計(jì)數(shù)0.20×109/L，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)6.41×1012/L，血紅蛋白154 g/L，血小板計(jì)數(shù)5×109/L，中性粒細(xì)胞絕對(duì)值0，紅細(xì)胞平均體積72.2 fL，平均血紅蛋白含量24.0 PG，降鈣素原(PCT)0.82 ng/mL。骨髓活檢：HE及PAS染色示骨髓增生極度活躍，BCR/ABL(P190、P210)融合基因未見異常。JAK2/V617F(71.21%)陽(yáng)性、JAK2-EXON12陰性、MPL-EXON10陰性。血清EPO正常。

1.4 診療經(jīng)過(guò) 住院期間共輸注B型Rh陽(yáng)性單采少白細(xì)胞血小板20 U預(yù)防出血，對(duì)相關(guān)血液病治療。抗感染方面，入院后予以頭孢曲松2.0 g qd抗感染治療，2天后患者體溫?zé)o下降。7月16日根據(jù)血培養(yǎng)危急值結(jié)果調(diào)整抗菌藥物為甲硝唑聯(lián)合美羅培南1 g q8h，7月17日體溫最高38.1 ℃，無(wú)發(fā)熱寒戰(zhàn)。繼續(xù)抗感染治療3天后無(wú)發(fā)熱，復(fù)查血常規(guī)：白細(xì)胞計(jì)數(shù)15.61×109/L，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)5.58×1012/L，中性粒細(xì)胞百分比81.8%，血紅蛋白135 g/L，血小板計(jì)數(shù)135×109/L。于7月23日無(wú)感染癥狀出院。

1.5 血培養(yǎng)及細(xì)菌鑒定

1.5.1 血培養(yǎng) 于7月14日患者發(fā)熱初始時(shí)抽取患者左、右上肢靜脈血(8～10 mL)注入需氧和厭氧血培養(yǎng)瓶(雙側(cè)雙瓶)，置于法國(guó)生物梅里埃公司BacT ALERT3D全自動(dòng)血培養(yǎng)儀內(nèi)培養(yǎng)，左側(cè)、右側(cè)厭氧瓶分別培養(yǎng)28.25、27.12 h后報(bào)警陽(yáng)性，培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)液體直接涂片革蘭染色，可見革蘭陰性、極長(zhǎng)、彎曲、盤繞在一起的桿菌，見圖1，同時(shí)轉(zhuǎn)種血平板、中國(guó)藍(lán)平板置于厭氧袋內(nèi)35℃培養(yǎng)，24 h后血平板可見針尖大小、灰白色、略干燥、無(wú)溶血的菌落，48 h后菌落增大，直徑約0.5～1 mm，見圖2，菌落在生理鹽水中呈塊狀、不乳化，雙側(cè)需氧瓶120 h 報(bào)陰性。

圖1 血培養(yǎng)涂片革蘭染色(×1 000)Figure 1 Gram-staining of blood culture(×1 000)

圖2 血平板轉(zhuǎn)種物厭氧培養(yǎng)48 h后生長(zhǎng)的菌落形態(tài)Figure 2 Colony morphology on blood agar plate after 48 hours of anaerobic culture

1.5.2 細(xì)菌鑒定 菌落涂片染色為革蘭陰性長(zhǎng)桿菌，呈團(tuán)排列，見圖3。參照文獻(xiàn)[2]合成細(xì)菌通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列為，F(xiàn)：5’-CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3’，R：5’-ATCGG(C/T)TACCTTGTTACGACTTC-3’。PCR反應(yīng)體積為25 μL，Premix Taq 12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 5 μL，無(wú)菌雙蒸水5.5 μL。擴(kuò)增后將產(chǎn)物送至上海生工生物公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在PubMed-NCBI-BLAST進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果為牙周梭桿菌。

圖3 純培養(yǎng)涂片革蘭染色(×1 000)Figure 3 Gram-staining of pure culture (×1 000)

2 文獻(xiàn)復(fù)習(xí)

以“Fusobacteriumperiodonticum”和“bacteremia”為關(guān)鍵詞，通過(guò)PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，未檢索出關(guān)于牙周梭桿菌菌血癥的相關(guān)報(bào)道。在中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)以“牙周梭桿菌”為關(guān)鍵詞檢索，未檢索出相關(guān)文獻(xiàn)，無(wú)法結(jié)合該例患者的病例資料、臨床表現(xiàn)、治療轉(zhuǎn)歸等方面進(jìn)行分析。單獨(dú)以“Fusobacteriumperiodonticum”為關(guān)鍵詞，檢索到9篇相關(guān)文獻(xiàn)。文獻(xiàn)對(duì)該菌的介紹內(nèi)容不多，主要介紹使用一定方法在特定部位檢出該菌的情況，鑒定方法及分離部位匯總見表1。

表1 牙周梭桿菌相關(guān)文獻(xiàn)匯總Table 1 Summary of relevant literatures about Fusobacterium periodonticum

3 討論

牙周梭桿菌引起的血流感染在國(guó)內(nèi)外未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，該菌生長(zhǎng)緩慢，菌落難于乳化，在實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌培養(yǎng)鑒定中，很難對(duì)該菌進(jìn)行快速的鑒定，并且該菌的相關(guān)文獻(xiàn)及病例報(bào)道很難查找，因此本文對(duì)該菌的快速鑒定具有較為重要的診斷價(jià)值，本例通過(guò)PCR和基因測(cè)序判定為牙周梭桿菌引起的敗血癥。

牙周梭桿菌屬是一類革蘭染色陰性、無(wú)芽孢的細(xì)長(zhǎng)梭形桿菌，對(duì)氧十分敏感，分離培養(yǎng)需要嚴(yán)格厭氧環(huán)境。Jiang等[10]在對(duì)兒童唾液進(jìn)行16S rRNA菌群多樣性分析中發(fā)現(xiàn)牙周梭桿菌是口腔中常見定植菌，在非齲齒人群中檢出率高于齲齒組。該菌可正常定植在牙齦溝和牙周袋，當(dāng)口腔免疫力低下、細(xì)菌組成和數(shù)量變化以及細(xì)菌易位可引起口腔和身體其他部位的感染[12]?？谇桓腥臼且环N慢性感染性疾病，主要包括口腔潰瘍、牙齦炎、牙周炎、牙髓炎、智齒冠周炎、齒齦膿腫等[13]，主要由厭氧菌引起，陳東科等[14]發(fā)現(xiàn)牙齦炎患者中梭桿菌引起的感染占79.5%，本病例中的患者經(jīng)診斷后發(fā)現(xiàn)有口腔感染，并且出現(xiàn)齒齦紅腫、出血，推測(cè)牙周梭桿菌是通過(guò)口腔感染入血引起敗血癥。

對(duì)PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到的牙周梭桿菌的相關(guān)資料進(jìn)行分析，在鑒定方法上，文獻(xiàn)中的標(biāo)本均未經(jīng)培養(yǎng)，而是直接用分子生物學(xué)的方法在標(biāo)本中對(duì)牙周梭桿菌進(jìn)行檢測(cè)。9篇文獻(xiàn)中除1篇文獻(xiàn)[9]使用PCR方法對(duì)牙周梭桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行鑒定不涉及口腔外，其余8篇文獻(xiàn)均在口腔不同部位分離到牙周梭桿菌，其中1篇文獻(xiàn)[11]在重癥機(jī)械通氣患者中監(jiān)測(cè)出牙周梭桿菌的定植，其余7篇文獻(xiàn)中的牙周梭桿菌均在牙周炎或齲齒患者中分離，且分離部位均為口腔，推測(cè)牙周梭桿菌在口腔疾病中的作用不容忽視，但未提及具體致病機(jī)制，尚需進(jìn)一步研究。

血液病患者往往免疫力極其低下，容易并發(fā)各種感染，如未及時(shí)救治，極易導(dǎo)致敗血癥、感染性休克甚至死亡，患者的預(yù)后高度依賴于早期發(fā)現(xiàn)、診斷及合理的治療。本例患者感染初期為口腔感染，早期抗菌藥物治療無(wú)效后進(jìn)展為敗血癥，血流感染的牙周梭桿菌可能來(lái)源于口腔。根據(jù)2016年美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)，梭桿菌藥敏需采用厭氧條件下瓊脂稀釋法，條件十分嚴(yán)格，根據(jù)CLSI M100-100S厭氧菌累積藥物敏感性報(bào)告，梭桿菌對(duì)氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、美羅培南、甲硝唑、莫西沙星、克林霉素的敏感率均為100%，本例患者用藥調(diào)整為甲硝唑聯(lián)合美羅培南治療有效，入院初期使用頭孢曲松抗感染治療無(wú)效，可能與該菌對(duì)頭孢曲松耐藥等因素有關(guān)，具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。由于中性粒細(xì)胞在病原菌引起的急性炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著趨化、吞噬、殺菌作用，特別是對(duì)黏膜表面細(xì)菌[15]，因此，粒細(xì)胞缺乏癥患者，應(yīng)注意加強(qiáng)其口腔衛(wèi)生，預(yù)防內(nèi)源性感染引起的菌血癥。本文結(jié)合病例對(duì)該菌的形態(tài)特點(diǎn)、培養(yǎng)特性、鑒定方法作了報(bào)告，將對(duì)于微生物工作人員提高此菌的鑒定能力，以及其感染患者的診治起到至關(guān)重要的作用。