謝琳 丁寧 徐靈博 姜怡鄧 楊曉玲 馬勝超 焦運(yùn)

1寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（銀川 750004）；2寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院（銀川 750002）

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是蛋氨酸代謝的中間產(chǎn)物，已被證實(shí)是動(dòng)脈粥樣硬化（ath?erosclerosis，As）重要的獨(dú)立危險(xiǎn)因子之一［1］。最近的研究表明Hcy水平與肝病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切［2］，同時(shí)有文獻(xiàn)報(bào)道［3］Hcy可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERs）。叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O1（forkhead box transcription factor O1，F(xiàn)oxO1）是FoxO亞家族中的主要成員之一。據(jù)報(bào)道，F(xiàn)oxO1主要在糖脂代謝活躍的器官，如肝臟、脂肪和骨骼肌等中表達(dá)，在動(dòng)物的生長發(fā)育、細(xì)胞分化、代謝及凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面都發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能［4］。ERs是各種原因?qū)е碌奈凑郫B或錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的堆積，而長時(shí)間處于ERs狀態(tài)或ERs超過自身處理能力時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)會(huì)啟動(dòng)程序性細(xì)胞凋亡過程，從而引起細(xì)胞凋亡［5］。DNA甲基化作為一種重要的表觀遺傳學(xué)調(diào)控，常發(fā)生在富含CpG島序列的胞嘧啶5′位上，使得被修飾的DNA空間結(jié)構(gòu)或染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而導(dǎo)致基因表達(dá)改變［6］。然而，有關(guān)同型半胱氨酸誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激致肝細(xì)胞凋亡的報(bào)道卻鮮有報(bào)道。因此，本研究主要探討Hcy誘導(dǎo)ERs致肝細(xì)胞凋亡過程中FoxO1的調(diào)控作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器同型半胱氨酸、葉酸和維生素B12（美國，Sigma）；Annexin V?FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（上海，Best bio）；基因組DNA提取試劑盒、總RNA提取試劑盒（北京，天根）；逆轉(zhuǎn)錄和qRT?PCR試劑盒（美國，Thermo Fisher）；蛋白提取試劑盒、蛋白定量試劑盒（南京，凱基）；DNA甲基化修飾試劑盒（美國，ZYMO）；FOXO1抗體（英國，Abcam）；引物由上海生工生物工程有限公司合成。超凈工作臺(tái)（蘇州，安泰）；CO2培養(yǎng)箱（德國，Heraeus）；5415D型微量臺(tái)式離心機(jī)（德國，Ep?pendorf）；BS110S型精密天平（德國，Sartorius）；熒光定量PCR儀（上海，楓嶺）；垂直電泳儀和Mod?el680全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國，Bio?Rad）。

1.2 方法用 含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)人肝細(xì)胞，置于37℃、5%CO2濃度的培養(yǎng)箱中。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時(shí)，用終濃度為0μmol/L Hcy、100μmol/L Hcy和100μmol/L Hcy+葉酸+維生素B12干預(yù)，其中0μmol/L Hcy為對(duì)照組，100μmol/L Hcy為Hcy組，100μmol/L Hcy+葉酸+維生素B12為干預(yù)組。干預(yù)細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡水平用不含EDTA的胰酶消化肝細(xì)胞后離心，收集細(xì)胞。用冷PBS洗滌細(xì)胞2次，1 000 g、4℃離心5 min收集細(xì)胞。用400μL 1×Annexin V結(jié)合液懸浮細(xì)胞，濃度大約為1×106cells/mL。加入5μLAnnexin V?FITC染色液，輕輕混勻后于4℃避光孵育15 min。加入10μL PI染色液后輕輕混勻于4℃避光孵育5 min。立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，以FITC和PI熒光作雙參數(shù)點(diǎn)圖，細(xì)胞分為4個(gè)象限：左下象限為活細(xì)胞，右下象限為早期凋亡細(xì)胞，右上象限為晚期凋亡和死亡細(xì)胞，左上象限為機(jī)械損傷細(xì)胞。

1.2.2 qPCR檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因及FoxO1mRNA的表達(dá)根據(jù)試劑盒說明書提取肝細(xì)胞總RNA，GeneBank數(shù)據(jù)庫查詢FOXO1及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因GRP78、ATF6、PERK、XBP?1序列并設(shè)計(jì)引物。FoxO1：上游：5′?AAGAGCGTGCCCTACTTC?AA?3′，下游：5′?TTCCTTCATTCTGCACACGA?3′；GRP78：上游：5′?GCTGGTGTCCTCTCTGGTGA?3′，下游：5′?ATTATCGGAAGCCGTGGAG?3′；ATF6：上游：5′?GGCAGTGTGGTCTTTCCTGT?3′，下游：5′?AAGCATCCGTTCTCATCACC?3′；CHOP：上游：5′?ACAGAGGTCACACGCACATC?3′，下游：5′?CTCCT?GCTCCTTCTCCTTCA?3′；XBP?1：上游：5′?AAAC?AGAGTAGCAGCTCAGACTGC?3′，下游：5′?TCCTT?CTGGGTAGACCTCTGGGAG?3′。PCR 擴(kuò) 增程序：95℃ 5 min，95℃ 1 0 s，54 ℃ 3 0 s，72℃ 3 0 s，72 ℃10 min，共40個(gè)循環(huán)，并設(shè)空白對(duì)照和內(nèi)參（GADPH）對(duì)照，同體系擴(kuò)增目的基因的相對(duì)量根據(jù)公式2?△△Ct計(jì)算，△△Ct=［CtASPP（2待測(cè)樣本）-CtGADPH（待測(cè)樣本）］-［CtASPP（2校正樣本）-CtGADPH（校正樣本）］。

1.2.3 Westernblot檢測(cè)FoxO1蛋白表達(dá)取30μg總蛋白并加入上樣緩沖液煮沸變性5 min，經(jīng)SDS/PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉后與1∶1 000稀釋的一抗在4℃孵育過夜，再與1∶5 000稀釋的二抗室溫孵育2 h，PBST清洗3次，每次5 min，曝光。用凝膠圖像分析成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析，結(jié)果以目的條帶面積灰度值做半定量檢測(cè)。

1.2.4 nMS?PCR檢測(cè)FoxO1啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平按DNA提取試劑盒說明書提取各組細(xì)胞全基因組DNA，亞硫酸鹽修飾法對(duì)全基因組DNA進(jìn)行甲基化修飾。nMS?PCR法檢測(cè)FoxO1啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化程度的改變。針對(duì)FoxO1啟動(dòng)子區(qū)，在線（http：//www.urogene.org/cgi?bin/methprimer/methprimer.cgi）設(shè)計(jì)一對(duì)外引物及兩對(duì)內(nèi)引物（外引物：上游：5′?TTAGGTGTGTGGTGATGTTAGGTAT?3′，下游：5′?CAAACAACAAAACTCCAAATAACAT?3′；甲基化引物：上游：5′?TAGAGTTGTAGAAGAC?GA CGGTC?3′，下游5′?CAAAAAAATATAAAAAAA?CATCGAA?3′；非甲基化引物：上游：5′?TAGAGTT?GTAGAAGATGATGGTTGA?3′，下游：5′?CAAAAAA?ATATAAAAAACATCAAA?3′）。（反應(yīng)體系：PCR MIX 12.5μL、H2O 7μL、上下游引物各1μL、已修飾的DNA 3.5μL，共25μL）外引物擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，20個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)降0.5℃至53℃，72℃7 min。以外引物的PCR產(chǎn)物為模板，進(jìn)行內(nèi)外引物的擴(kuò)增，反應(yīng)條件同外引物。隨之，取5μL PCR產(chǎn)物于2%的瓊脂糖凝膠上電泳，用凝膠成像分析儀成像并分析甲基化條帶及甲基化條帶的光密度，按如下公式進(jìn)行計(jì)算：甲基化/%=甲基化OD值/（甲基化OD值+非甲基化OD值）×100%。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析整理，計(jì)量資料以s表示，多組間兩兩比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人肝細(xì)胞凋亡水平Annexin?VFITC染色、流式細(xì)胞定量定性分析肝細(xì)胞凋亡水平，結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，Hcy組肝細(xì)胞凋亡水平增加（P＜0.05），而干預(yù)組較Hcy組凋亡水平降低（P＜0.05）。見圖1。

圖1 Hcy對(duì)肝細(xì)胞凋亡的影響Fig.1 Effect of Hcy on hepatocyte apoptosis

2.2 肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平為了證明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）在肝細(xì)胞凋亡中的作用，采用qRT?PCR檢測(cè)肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因GRP78、ATF6、PERK及XBP?1 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，GRP78、AFP6、PERK、XBP?1 mRNA在Hcy組中明顯升高（P＜0.001，P＜0.01，P＜0.001，P＜0.001），而干預(yù)組較Hcy組有所降低（P＜0.001，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.001），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2。

圖2 肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因mRNA的表達(dá)水平Fig.2 Expression levels of mRNA for genes related to endoplasmic reticulum stress in hepatocytes

2.3 FoxO1在Hcy致肝細(xì)胞凋亡中的表達(dá)qRT?PCR和Western blot分別檢測(cè)FoxO1 mRNA及蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，Hcy組FoxO1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.01，P＞0.05），而干預(yù)組較Hcy組下降（P＜0.001，P＞0.05）。見圖3。

2.4 人肝細(xì)胞FoxO1DNA甲基化水平改變nMS?PCR檢測(cè)FoxO1 DNA甲基化水平，結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，Hcy組FoxO1 DNA甲基化水平降低（P＜0.05），而干預(yù)組與Hcy組比較，F(xiàn)oxO1 DNA甲基化水平升高（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖4。

圖3 FoxO1在Hcy致肝細(xì)胞凋亡中的表達(dá)水平Fig.3 Expression levels of FoxO1 in Hcy?induced hepatocyte apoptosis

圖4 nMS?PCR法檢測(cè)FoxO1的DNA甲基化水平Fig.4 DNA methylation levels of FoxO1 detected by nMS?PCR

3 討論

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是一種含巰基的非必需氨基酸，主要來源于飲食攝取的蛋氨酸，是多種疾病的危險(xiǎn)因子［7］。有研究報(bào)道［8-9］，Hcy與慢性肝病、肝臟脂質(zhì)代謝紊亂、肝炎等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。同時(shí)，Hcy可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生凋亡，但Hcy經(jīng)過何種途徑誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生，其具體機(jī)制尚未清楚。

最近研究［10］發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞處于劇烈的化學(xué)刺激或者能量代謝失衡時(shí)，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)將被破壞，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能發(fā)生紊亂，主要表現(xiàn)為二硫鍵不能形成，引起蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊及蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)積聚，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。梁平平等［11］研究發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞生長因子21（FGF21）在ERs誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡中具有保護(hù)作用，F(xiàn)GF21通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡信號(hào)通路，減少心肌細(xì)胞凋亡。本文的研究結(jié)果表明，隨著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平的升高，肝細(xì)胞凋亡水平也隨之升高，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)與肝細(xì)胞凋亡之間存在著一定聯(lián)系。

FoxO蛋白是在DNA結(jié)合域具有高度保守的翼狀一螺旋結(jié)構(gòu)的一類轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。FoxO1作為FoxO家族中最早被發(fā)現(xiàn)的成員，是調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)及增殖、凋亡的重要轉(zhuǎn)錄因子［12-13］。有研究報(bào)道［14］，F(xiàn)oxO1在前列腺癌細(xì)胞中過度表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致TRAIL表達(dá)增高，從而引起癌細(xì)胞凋亡增加。此外，F(xiàn)oxO1去磷酸化水平增高，引起FoxO1在肝星狀細(xì)胞核中積累，從而促進(jìn)了TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明，肝細(xì)胞凋亡水平增高的同時(shí)，F(xiàn)oxO1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均升高，反之，則相反。提示肝細(xì)胞凋亡可能受到FoxO1的調(diào)控，但其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

DNA甲基化是指在甲基化轉(zhuǎn)移酶的催化下，DNA序列中的腺嘌呤（A）或胞嘧啶（C）堿基與甲基發(fā)生共價(jià)結(jié)合，并且可以在細(xì)胞分裂過程中傳遞給子細(xì)胞的表觀遺傳現(xiàn)象［15］。DNA甲基化在表觀遺傳學(xué)中發(fā)揮著重要的作用，雖然不改變核苷酸序列，卻能調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子位置的DNA甲基化能抑制基因的轉(zhuǎn)錄，并且能與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變甚至是X染色體失活［16］。目前，DNA甲基化作為一種調(diào)控FoxO1表達(dá)的機(jī)制日益成為人們研究的熱點(diǎn)，但是關(guān)于FoxO1基因DNA異常甲基化與肝細(xì)胞凋亡的相關(guān)性研究尚屬于全新的領(lǐng)域，有待進(jìn)一步探索。本文的研究結(jié)果表明，Hcy組FoxO1的DNA甲基化水平提高，同時(shí)FoxO1的mRNA與蛋白表達(dá)水平降低，提示FoxO1的表達(dá)水平可能受到DNA甲基化調(diào)控的影響。

綜上所述，F(xiàn)oxO1啟動(dòng)子區(qū)DNA高甲基化參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡，為進(jìn)一步研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。