柴生颋 謝平金 史桐雨 萬雷 劉海全 林勇

1. 廣州中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院骨科，廣東 廣州 510240 2.廣州中醫(yī)藥大學嶺南醫(yī)學研究中心中醫(yī)骨傷科學實驗室，廣東 廣州 510405 3.廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州 510405

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是臨床常見的骨骼疾病之一，是一種由于骨強度降低而使骨折風險升高的全身性骨骼疾病，目前已在世界常見病多發(fā)病中居第七位，成為世界性前沿研究難題。且隨著老齡化社會的到來，目前OP的發(fā)病率正以驚人的速度增長，防治骨質(zhì)疏松癥已成為當今國際上的研究熱點。本研究利用腺病毒超表達和沉默技術研究 Wnt信號通路抑制因子分泌型卷曲相關蛋白1(sFRP1)在成骨細胞增殖分化中的作用,并探索補腎方藥對 sFRP1 的影響，以期從細胞分子學角度探討補腎方藥(骨康方)防治OP的作用機理。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物及細胞：大鼠骨肉瘤細胞(UMR106細胞)由中國科學院上海細胞所細胞庫提供；4月齡 SD 雌性大鼠40只，用于制備含藥血清。

1.1.2實驗藥物：補腎方藥(淫陽藿 10 g、 熟地黃 10 g、 肉蓯蓉 10 g、 大棗 10 g、 當歸10 g、 丹參 10 g、 菟絲子 10 g、 補骨脂 10 g、 黃芪 10 g、白芍 10 g)，在本院制劑室常規(guī)水煎制、濃縮，生藥含量為1.43 g/mL。陽性對照藥：戊酸雌二醇片(補佳樂，J20130009)。

1.1.3儀器和試劑：DMEM 高糖培養(yǎng)基、FBS、胰酶(美國Gibco 公司)，CCK8 (中國同仁化學公司)，BCA 蛋白定量試劑盒(中國弗德生物公司)，EGTA、Triton(美國Sigma 公司)，脫脂奶粉(美國BD 公司)，β-連環(huán)蛋白(β-catenin)抗體(Abcam，貨號：ab32572)，GAPDH抗體(上?？党?，貨號：RC-5G5)，PVDF 膜(美國Millipore 公司)，細胞培養(yǎng)箱、離心機(美國Thermo Fisher 公司)，流式細胞儀(美國BD公司)，超凈操作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)。

1.2 制備含藥血清

根據(jù)前期研究方法[1]制備含藥血清：將4月齡 SD 雌性大鼠16只隨機分成生理鹽水組、中藥灌胃組，每組8只。中藥灌胃組按4.8 g生藥/kg 大鼠體重灌胃，空白血清組每只大鼠灌胃生理鹽水大約20 mL/ kg。每天2次，間隔5 h，連續(xù)6 d。第七天進行腹主動脈取血，并分離血清，過濾后分裝，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 目的基因重組腺病毒載體構(gòu)建

1.3.1SFRP1沉默重組腺病毒載體構(gòu)建:在NCBI 數(shù)據(jù)庫查詢參考核苷酸序列SFRP1(942 bp)，采用Primer 5.0設計PCR引物，設計出特異性針對SFRP1的序列和無關對照序列(Scr)，并在兩端分別加入AgeⅠ、EcoRⅠ酶切位點。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)的DH5α細胞，用質(zhì)粒小提試劑盒提取轉(zhuǎn)化到DH5α細胞重組質(zhì)粒，對提取的重組質(zhì)粒進行測序鑒定，提取測序正確的腺病毒，經(jīng)培養(yǎng)提取無內(nèi)毒素質(zhì)粒，再經(jīng)過篩選及病毒包裝，成功構(gòu)建沉默SFRP1腺病毒載體，將鑒定正確的重組腺病毒包裝質(zhì)粒命名為沉默SFRP1(Ad-shSFRP1)。

1.3.2SFRP1過表達重組腺病毒載體構(gòu)建:在NCBI 數(shù)據(jù)庫查詢參考核苷酸序列SFRP1(942 bp)，采用Primer 5.0設計PCR引物，并添加 KpnⅠ、NotⅠ酶切位點。以cDNA為模板，擴增SFRP1基因，與穿梭質(zhì)粒pENTER、PCR 產(chǎn)物KpnⅠ、NotⅠ雙酶切，在T4 DNA酶作用下將SFRP1基因與穿梭質(zhì)粒連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài) DH5α，挑選抗性克隆進行酶切鑒定，轉(zhuǎn)化子涂布Kan+抗性平板，對提取的重組穿梭質(zhì)粒用 KpnⅠ、XhoⅠ雙酶切進行測序鑒定。PmeⅠ酶切線性化重組質(zhì)粒，PacⅠ酶切鑒定重組腺病毒質(zhì)粒，將鑒定正確的重組腺病毒包裝質(zhì)粒命名為過表達SFRP1(Ad-SFRP1)。重組腺病毒包裝質(zhì)粒經(jīng) Pac I 酶切線性化后，用 Lipofectamine 2000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 HEK-293 細胞，收集病毒液，測定病毒滴度。

1.4 UMR106細胞培養(yǎng)

UMR106細胞以 1×106個/mL 接種于T 75培養(yǎng)瓶，加入適量 DMEM 高糖培養(yǎng)基[含體積分數(shù) 10%胎牛血清(FBS)，1%青霉素—鏈霉素(Pen/Strep)]于體積分數(shù) 5% CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待長至80%左右融合，消化、收集細胞，以 1∶3 比例進行傳代。

1.5 重組腺病毒感染 UMR106細胞

UMR106細胞培養(yǎng)24 h 后分為空載病毒組(NC對照組)、沉默SFRP1(Ad-shSFRP1)組、過表SFRP1組(Ad-SFRP1)，分別用相應空載腺病毒、重組腺病毒Ad-shSFRP1、重組腺病毒Ad-SFRP1感染各組UMR106 細胞，感染復數(shù)(MOI) 為50，重組腺病毒感染48 h后，分別消化收集細胞，采用qPCR、Western Blot 檢測SFRP1在UMR106 細胞中的表達，并確定腺病毒干預成功。

1.6 含藥血清干預及CKK8 檢測UMR106細胞增殖

將上述空載腺病毒、重組腺病毒Ad-shSFRP1、重組腺病毒Ad-SFRP1感染的各組UMR106 細胞，分成空白血清+空病毒組、含藥血清+空病毒組、空白血清+SFRP1沉默組、含藥血清+SFRP1沉默組、空白血清+SFRP1過表達組、含藥血清+SFRP1過表達組，每組分別用含藥血清和空白血清干預，分別培養(yǎng)72 h。細胞處理結(jié)束的前4 h，吸去培養(yǎng)液，按每100 μL完全培養(yǎng)基加入10 μL CCK-8將兩者混合均勻后，每孔加入100 μL的CCK-8混合液，避免產(chǎn)生氣泡，將培養(yǎng)板放到培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，4 h后，將96孔板中的培養(yǎng)基移至酶標板中，酶標儀檢測450 nm處的OD值。

1.7 β-catenin蛋白檢測

各組經(jīng)血清分別培養(yǎng)72 h后，按比例加入裂解液，充分裂解后，12 000 r/min離心2～5 min，取上清液。提取總蛋白，測定蛋白濃度。加入5×SDS蛋白上樣緩沖液(5∶1)，100 ℃煮沸5 min，-20 ℃保存?zhèn)溆?。分別置于濃縮膠和分離膠中電泳，350mA轉(zhuǎn)膜70 min。37 ℃封閉液中封閉1 h；將PVDF膜分別放入裝有3 mL稀釋后的β-catenin(稀釋比例1∶5 000，轉(zhuǎn)膜條件：300 mA恒流轉(zhuǎn)膜90 min)或者GAPDH(稀釋比例：1∶ 10 000)，25 mL TBST洗滌PVDF膜3次，每次5 min；將PVDF膜放入含有3 mL辣根過氧化物酶標記的稀釋二抗溶液的小槽內(nèi)，置于搖床上室溫平緩搖動40 min(二抗：HRP Goat anti-Rabbit IgG(BOSTER，貨號：BA1054，稀釋比例：1∶20 000，孵育條件：室溫孵育40 min)25 mL TBST洗滌PVDF膜3次，每次7 min；用化學發(fā)光顯色后進行圖像分析，經(jīng)軟件分析，以β-catenin/GAPDH比值表示β-catenin蛋白表達水平。

1.8 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 各組干預對 UMR106 細胞增殖的影響

干預24、48、72 h后，與空白血清+空病毒組比較，含藥血清+空病毒組細胞增殖顯著增高(P<0.05)；與空白血清+SFRP1沉默組比較，含藥血清+SFRP1沉默組細胞增殖顯著增高(P<0.05)；與空白血清+SFRP1過表達組比較，含藥血清+SFRP1過表達組細胞增殖顯著增高(P<0.05)。

表1 各組干預對 UMR106 細胞增殖的影響(OD450 nm值)Table 1 The effect of each intervention on the proliferation of UMR106 cells (OD450 nm value)

注： 與空白血清+空病毒組比較，*P<0. 05；與空白血清+SFRP1沉默組比較，△P<0.05；與空白血清+SFRP1過表達組比較，#P<0. 05。

2.2 各組UMR106細胞中β-catenin蛋白表達

圖1 各組UMR106細胞中β-catenin蛋白表達水平Fig.1 The β-catenin protein expression level in each group of UMR106 cells

圖2 各組UMR106細胞中β-catenin表達凝膠電泳圖Fig.2 The Gel electrophoresis of the expression of β-catenin in each group of UMR106 cells

各組UMR106細胞β-catenin蛋白表達比較中，空白血清+SFRP1過表達組<空白血清+空病毒組<空白血清+SFRP1沉默組(P<0.05)，且兩兩組間比較中空白血清+SFRP1過表達組<含藥血清+SFRP1過表達組(P<0.05)；空白血清+空病毒組<含藥血清+空病毒組P<0.05)；空白血清+SFRP1沉默組<含藥血清+SFRP1沉默組(P<0.05)。

3 討論

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種由于骨強度降低而使骨折風險升高的全身性骨骼疾病，且隨著老齡化社會的到來，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率目前正以驚人的速度增長，防治骨質(zhì)疏松癥已成為當今國際上的研究熱點。中醫(yī)認為骨質(zhì)疏松癥屬于“骨痿”范疇，其病位在腎，發(fā)病關鍵是“腎虛”。隨著年齡增長，腎中精氣由充盛轉(zhuǎn)而逐漸衰敗，性腺功能亦隨之漸漸衰退。我們在前期研究發(fā)現(xiàn)[2]，補腎(骨康方)可以增加絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者骨密度；且其含藥血清對成骨細胞和破骨細胞均有影響，可改變細胞生存環(huán)境中OPG/ RANKL的比例，間接影響著破骨細胞的功能活性[3]；亦通過構(gòu)建過表達及沉默 DKK1、Sost 重組腺病毒載體技術，研究發(fā)現(xiàn)補腎方藥(骨康方)能夠通過調(diào)控Wnt信號通路中DKK1的表達，來影響成骨細胞的代謝[4-6]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)[7]，sFRP1與Wnt信號通路中的frizzled受體有著相似的富含半胱氨酸區(qū)的分泌蛋白，被認為可與間質(zhì)中循環(huán)的Wnt結(jié)合，從而阻止Wnt蛋白與質(zhì)膜上的frizzled受體結(jié)合，對Wnt信號通路起負調(diào)控作用。而且在sFRP1阻止Wnt蛋白與質(zhì)膜上的frizzled受體結(jié)合后，通過在內(nèi)皮細胞細胞質(zhì)中測定發(fā)現(xiàn)β-catenin水平的下降，提示sFRP1主要是抑制經(jīng)典的Wnt/β-catenin通路[8]。β-catenin的表達從一定程度上代表了Wnt /β-catenin信號通路的功能狀態(tài)。β-catenin基因突變可引起小鼠骨量減少及破骨細胞數(shù)量增加[9]。研究表明[10]，β-catenin不僅能夠增加ALP的表達、提高骨鈣素啟動子的活性，而且能響應機械負荷的骨形成所需[11]。

本研究利用腺病毒超表達和沉默技術研究 Wnt信號通路抑制因子 sFRP1 在成骨細胞增殖分化中的作用,并探索補腎方藥對 sFRP1 的影響。空白血清+空病毒組比較，空白血清+SFRP1沉默組的細胞增殖以及β-catenin蛋白表達均顯著升高，而空白血清+SFRP1過表達組的細胞增殖以及β-catenin蛋白表達均則顯著降低，這說明SFRP1作為Wnt信號通路起負調(diào)控因子影響了骨細胞的代謝。而與空白血清+SFRP1過表達組比較，含藥血清+SFRP1過表達組和空白血清+SFRP1沉默組的細胞增殖以及β-catenin蛋白表達亦顯著升高，這說明補腎方藥(骨康方)能夠通過抑制SFRP1表達來調(diào)節(jié)骨細胞代謝。在各組比較中沉默sFRP1、補腎方藥含藥血清可提高UMR106細胞增殖以及β-catenin表達，尤以兩者同時干預時的作用最強。另外與空白血清+SFRP1沉默組比較，含藥血清+SFRP1沉默組的細胞增殖以及β-catenin蛋白表達亦有升高，故筆者推測補腎方藥(骨康方)促進 UMR106細胞增殖、上調(diào)β-catenin蛋白表達，可能不僅作用于sFRP1這一個靶點，可能是多靶點作用。研究接下來將針對此結(jié)果，進行腺病毒感染的大鼠動物實驗，以充分探討補腎方藥對 sFRP1 的影響及其它相關作用機理，為防治骨質(zhì)疏松等骨代謝疾病提供更有力實驗證據(jù)和可行研究思路。