王贖 張莉 劉芬芬 劉煥兵 張偉

1. 南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年科，江西 南昌 330006 2. 南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸科，江西 南昌 330006

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea hypopnea syndrome,OSAHS)是一種潛在的危險(xiǎn)性疾病，可累及心腦血管、神經(jīng)、內(nèi)分泌代謝等系統(tǒng)，導(dǎo)致多器官損傷，慢性間歇性缺氧是其主要特征之一。近來(lái)國(guó)內(nèi)外及本課題組的研究[1-4]均有證實(shí)OSAHS患者可出現(xiàn)骨密度(bone mineral density,BMD)下降，但具體的作用機(jī)制報(bào)道甚少。本研究的目的擬通過(guò)構(gòu)建慢性間歇性缺氧(chronic intermittent hypoxia,CIH)大鼠模型模擬OSAHS，探討CIH對(duì)骨代謝的影響及從骨保護(hù)素(osteoprotegerin,OPG)/核因子κ B受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-κ B ligand，RANKL)通路入手研究骨組織OPG、RANKL基因表達(dá)的改變。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇健康8周齡wistar大鼠20只，體重在(150 ± 10) g，由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SYXK(贛)2010-002。實(shí)驗(yàn)前適喂養(yǎng)1周，用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為正常對(duì)照組和CIH組，每組10只。

1.2CIH模型構(gòu)建

將兩組大鼠分別置于相同的玻璃模擬艙內(nèi)，CIH模擬艙內(nèi)循環(huán)交替給予不同流量氮?dú)?、氧氣?20 s為1個(gè)循環(huán)。連續(xù)給予氮?dú)?0 s，使艙內(nèi)最低氧濃度降至5%，維持5 s，隨后30 s充入氧氣使氧濃度恢復(fù)至21%并維持到下一循環(huán)開始。正常對(duì)照組艙內(nèi)持續(xù)充入壓縮空氣，氧濃度維持在21%。實(shí)驗(yàn)時(shí)間為每天9:00-17:00，期間觀察大鼠精神、活動(dòng)、睡眠等情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)束兩組大鼠取出放回常規(guī)飼養(yǎng)籠，自由飲水與攝食，每周7 d，共8周。CIH模擬艙購(gòu)自上海玉研科學(xué)儀器有限公司。

1.3相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

1.3.1骨密度測(cè)定：8周后將所有大鼠用7%水合氯醛腹腔注射麻醉后送至我院核醫(yī)學(xué)科，仰臥位放置于雙能X線骨密度儀(美國(guó)Hologic)檢測(cè)臺(tái)上，應(yīng)用小動(dòng)物軟件掃描測(cè)定大鼠全身、股骨及腰椎BMD。

1.3.2骨代謝指標(biāo)測(cè)定：將完成骨密度測(cè)定的大鼠行右心室采血并處死。離心機(jī)2 500 r/min 4 ℃離心20 min，取上清液存放于-70 ℃冰箱待測(cè)。應(yīng)用ELISA法檢測(cè)血清骨特異性堿性磷酸酶(BALP)、骨鈣素(BGP)、I型膠原N端前肽(PINP)、I型膠原羧基端肽β降解產(chǎn)物(β-CTX)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)水平。ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司，操作步驟嚴(yán)格按說(shuō)明書執(zhí)行。

1.3.3OPG、RANKL mRNA水平測(cè)定：大鼠處死后，立即取左后肢股骨，剝離附著的肌肉及結(jié)締組織，按Trizol 試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)說(shuō)明提取總 RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。以β-actin 作為內(nèi)參照，各基因引物序列由上海生工股份有限公司設(shè)計(jì)合成，詳見(jiàn)表1。Real-time PCR擴(kuò)增體系為25 μL：cDNA 4 μL，Hot Star Taq Master Mix (2×) 12.5 μL，上下游引物及探針各0.3 μL，滅菌去離子水補(bǔ)足25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?95 ℃ 10 min 激活 Hot Star Taq DNA合成酶，擴(kuò)增循環(huán)94 ℃ 45 s，72 ℃ 70 s，共40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增反應(yīng)在ABI7500實(shí)時(shí)熒光PCR系統(tǒng)上執(zhí)行。運(yùn)用2-ΔΔCt方法，比較兩組OPG、RANKL mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 各基因引物序列及擴(kuò)增長(zhǎng)度Table 1 Details of primers

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 17.0醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間兩兩比較，采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)過(guò)程大鼠一般情況

CIH組大鼠放入艙內(nèi)約3～4 h后，有出現(xiàn)精神萎靡、活動(dòng)減少、嗜睡等現(xiàn)象，隨著艙內(nèi)氧濃度改變，大鼠有反復(fù)的睡眠覺(jué)醒表現(xiàn)。

2.2兩組大鼠骨密度比較

與對(duì)照組比較，CIH組全身及股骨BMD降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 兩組大鼠骨代謝指標(biāo)比較Table 2 Comparison of BMD between the two groups

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.3兩組大鼠血清骨代謝指標(biāo)比較

與對(duì)照組比較，CIH組血清BGP降低，而血清β-CTX、TRAP升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表3。

2.4兩組大鼠OPG、RANKL mRNA表達(dá)水平

與對(duì)照組比較，CIH組股骨組織OPG mRNA相對(duì)表達(dá)量降低、RANKL mRNA相對(duì)表達(dá)量升高、OPG/RANKL比值降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表4。

表3 兩組大鼠骨代謝指標(biāo)比較Table 3 Comparison of bone metabolic indices between the two groups

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05,**P<0.01。

表4 兩組大鼠OPG、RANKL mRNA水平比較Table 4 Comparison of mRNA expression of OPG and RANKL between the two groups

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05,**P<0.01。

3 討論

OSAHS是指睡眠時(shí)上氣道塌陷阻塞引起的呼吸暫停和通氣不足、伴有打鼾、睡眠結(jié)構(gòu)紊亂、白天嗜睡等病征，其病理基礎(chǔ)為上氣道的狹窄和阻塞，造成間歇性缺氧，進(jìn)一步引起低氧血癥及高碳酸血癥，從而帶來(lái)機(jī)體一系列病理生理改變及多器官損傷。本研究通過(guò)慢性間歇性缺氧模擬OSAHS,發(fā)現(xiàn)在此環(huán)境下生存的大鼠3～4 h后有出現(xiàn)精神萎靡、活動(dòng)減少、嗜睡等現(xiàn)象，且隨著氧濃度改變，有反復(fù)的睡眠覺(jué)醒表現(xiàn)，這與其他研究者的結(jié)果相類似[5]。

骨代謝涉及骨形成及骨吸收兩方面，任何原因引起骨形成減少、骨吸收增加都會(huì)影響骨重建。本研究發(fā)現(xiàn)在CIH環(huán)境下大鼠骨形成指標(biāo)BGP降低，而骨吸收指標(biāo)β-CTX、TRAP增加，全身及股骨BMD下降，說(shuō)明CIH打破了骨代謝平衡，使骨質(zhì)疏松的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)明顯增加。張劉生等[6]的研究也指出與正常對(duì)照組相比，間歇性缺氧組SD大鼠血清 B-ALP 水平升高，骨礦鹽含量水平顯著降低，全身及股骨 BMD 顯著降低。Song等[7]的研究指出合并間歇性缺氧的去勢(shì)大鼠腰椎及股骨頸BMD較單純?nèi)?shì)大鼠均顯著下降，且骨形成指標(biāo)Runx2、ColⅠ、ALP的mRNA水平亦有下降，而骨吸收指標(biāo)TRAP-5b的mRNA水平卻顯著升高。但本研究中未發(fā)現(xiàn)兩組大鼠腰椎BMD的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與樣本量較少有關(guān)。

OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)是調(diào)節(jié)骨代謝的重要信號(hào)通路,成骨細(xì)胞分泌的OPG競(jìng)爭(zhēng)性的與RANKL結(jié)合，使其結(jié)合RANK的活性丟失，通路啟動(dòng)失敗，從而抑制了破骨細(xì)胞的活性。本研究發(fā)現(xiàn)CIH組大鼠股骨組織OPG mRNA的表達(dá)顯著降低而RANKL mRNA的表達(dá)顯著升高，OPG/RANKL比值下調(diào)，這與先前本課題組針對(duì)男性O(shè)SAHS患者測(cè)定血清OPG、RANKL水平后所得出的結(jié)論較為一致[4]，Yu等[8]研究也指出缺氧環(huán)境下人牙周膜細(xì)胞OPG mRNA表達(dá)水平明顯降低，而RANKL mRNA表達(dá)顯著升高，這些均提示慢性間歇性缺氧可能通過(guò)OPG/RANKL通路影響骨代謝，需進(jìn)一步研究來(lái)驗(yàn)證。骨組織中OPG/RANKL mRNA比率下調(diào)可能與缺氧引起的機(jī)體氧化應(yīng)激及炎癥因子釋放有關(guān)，Bai等[9]指出活化氧(ROS) 增高可引起 OPG 表達(dá)水平下降，RANKL 表達(dá)水平升高，RANKL-RANK 增多，OPG-RANK減少，促使破骨細(xì)胞形成、分化、成熟，骨吸收增加；García Pérez等[10]指出腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6 (IL-6) 可上調(diào) RANKL 的表達(dá)，破壞了骨形成與吸收之間的平衡。 除此之外，慢性間歇缺氧引發(fā)的氧化應(yīng)激及炎癥因子釋放可能直接與骨代謝密切相關(guān)，如ROS可降解骨基質(zhì)，活化破骨細(xì)胞及促進(jìn)破骨細(xì)胞分化；TNF-α 局部聚集直接刺激局部破骨細(xì)胞的形成。CIH導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的其他作用機(jī)制還可能包括[11]：低氧引起交感神經(jīng)系統(tǒng)(SNS)興奮，刺激腎上腺髓質(zhì)分泌腎上腺素和去甲腎上腺素，影響骨形成和骨吸收；缺氧條件下一些細(xì)胞因子，如低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)以及脂肪細(xì)胞因子Chemerin等的變化也可能與骨代謝密切相關(guān),因此慢性間歇缺氧對(duì)骨代謝的影響機(jī)制研究還需進(jìn)一步深入。

綜上所述，本研究從動(dòng)物水平進(jìn)一步揭示了慢性間歇性缺氧可使骨組織OPG mRNA表達(dá)減少、RNAKL mRNA表達(dá)增加，影響骨代謝，降低骨密度，使骨質(zhì)疏松的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加。CIH 是 OSASH 一系列病理生理改變的重要因素，希望更多的研究者能進(jìn)一步明確 CIH 導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生機(jī)制，為臨床OSASH 合并骨質(zhì)疏松患者的診斷、治療及預(yù)防提供一些重要的參考價(jià)值。