周 樺,何志旭,趙淑云,楊 朝,徐文杰,張 坤, 許文方,呂 晶,潘莉娜,黃官友,周從容,趙孝梅,王星慧

(1.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院婦產科生殖醫(yī)學中心，貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院兒科，貴陽 550004；3.貴州醫(yī)科大學干細胞與組織工程重點實驗室，貴陽 550004)

人卵胞漿內單精子顯微注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)注射時，承載精子的注射介質不可避免地會隨精子注入卵胞漿內。目前多數(shù)ICSI手術采用聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作為注射介質，然而PVP本身具有化學活性，對卵母細胞受精、卵裂、胚胎發(fā)育以及對子代潛在的影響一直為學界所擔憂。因此ICSI手術實施者們采用稀釋的方式盡可能減少PVP的注入量，以減輕PVP的不良影響[1]。本研究比較了ICSI操作中使用PVP、人血清蛋白(HAS)和血清替代品(SPS)作為注射介質，對于ICSI效果的影響，尋求可能取代PVP進行ICSI操作的注射介質。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年9月至2018年1月，在貴州醫(yī)科大學附屬院接受常規(guī)體外授精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)和ICSI-ET治療過程中患者廢棄的未成熟卵母細胞，經體外成熟后按每批成熟卵母細胞統(tǒng)一一種注射介質進行ICSI授精，注射介質按輪次使用。據(jù)ICSI所用的注射介質不同，分為PVP組(3.5% PVP)、HSA組、SPS組?；颊卟辉幸蛩貫檩斅压芤蛩鼗蚰蟹揭蛩亍１狙芯拷涃F州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準，所用未成熟卵母細胞和精子均為患者知情同意后自愿捐贈所得。

1.2試劑與材料 實驗所用注射介質、人輸卵管液培養(yǎng)基、卵裂培養(yǎng)基、囊胚培養(yǎng)基以及梯度離心液均為Quinn′s產品系列，購自美國SAGE公司；所用培養(yǎng)皿均購自美國BD Falcon公司。

1.3卵母細胞的準備 按本中心常規(guī)對患者進行促排卵，艾澤(Merck Serono，德國)250 μg扳機，34～36 h后采集卵母細胞。回收的可疑未成熟卵母細胞于倒置顯微鏡下觀察，未觀察到第一極體的未成熟卵母細胞進行體外成熟，24 h后酶消化去除顆粒細胞[2]，再次觀察卵母細胞，將排出第一極體的MⅡ期成熟卵母細胞納入實驗，按輪次選擇注射介質，進行ICSI授精。

1.4精子的準備 體外成熟卵母細胞行ICSI所用精子為本中心當日行IVF-ET的患者授精后剩余的擬丟棄精子。精子處理方式：液化后的精子用梯度離心液處理后再用精子洗滌培養(yǎng)基洗滌，受精用人輸卵管液培養(yǎng)基上游。

1.5ICSI 取上游后的精子加入精子洗滌培養(yǎng)基中，選擇形態(tài)正常、前向運動的精子進行制動。將制動成功的精子轉移進入不同注射介質的微滴中沖洗后，將精子和盡量少的注射介質一同注入卵胞漿，注射后的卵母細胞轉移至含5%HSA的卵裂培養(yǎng)基微滴中常規(guī)培養(yǎng)。

1.6胚胎培養(yǎng)及胚胎評級

1.6.1胚胎培養(yǎng) (1)ICSI后的卵子立即放入卵裂培養(yǎng)基中微滴培養(yǎng)，受精后19～20 h更換新鮮卵裂培養(yǎng)基，觀察受精情況，以出現(xiàn)原核(pronuclear，PN)或雙極體(polarbody，PB)作為受精的標志；以同時出現(xiàn)2PN以及2PB作為正常受精的標志[3]；(2)受精卵繼續(xù)培養(yǎng)，授精后66～68 h觀察胚胎卵裂情況，并將所有卵裂期胚胎轉移進入新鮮的囊胚培養(yǎng)基內繼續(xù)培養(yǎng)。

1.6.2胚胎評級 授精后66～68 h觀察卵裂情況。將正常受精并卵裂的胚胎，根據(jù)卵裂球大小是否均勻及有無碎片等標準對胚胎進行評估[4]。本中心將卵裂球≥6-細胞且≤10-細胞，評級為Ⅰ級或Ⅱ級的胚胎定義為優(yōu)質胚胎；授精后144 h觀察囊胚形成情況，并根據(jù)Gardner評分標準[5]進行囊胚評估。

1.7計算方法 受精率=(1PN+2PN+多PN+2PB)受精卵數(shù)/MⅡ卵子數(shù)×100%；正常受精率=正常受精卵子數(shù)/ MⅡ卵子數(shù)×100%；卵裂率=發(fā)生卵裂的受精卵數(shù)/總受精卵數(shù)×100%；優(yōu)質胚胎率=優(yōu)質胚胎數(shù)/總胚胎數(shù)×100%。

2 結 果

2.1患者一般情況 共納入129例不孕患者捐贈的共194枚卵母細胞，3組患者年齡、不孕年限、主要基礎性激素[卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)、黃體生成素(luteotropic hormone，LH)、雌二醇(estradiol，E2)]等參數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。3組捐贈精子的男性患者的年齡、主要精液常規(guī)參數(shù)[精子濃度、前向運動(progressive motility，PR)的精子比例和正常形態(tài)精子比例]比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表1 捐贈卵母細胞者一般情況

表2 捐贈精子者一般情況

2.2受精率、正常受精率、卵裂率、優(yōu)質胚胎率和囊胚形成情況的比較 受精率、正常受精率和卵裂率在3組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；HSA組和SPS組的優(yōu)質胚胎率顯著高于PVP組(P<0.05)，但HSA組和SPS組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；各組均有囊胚形成，見表3。各組代表性的優(yōu)質胚胎的形態(tài)學質量評估見圖1；各組形成的囊胚的形態(tài)學質量評估見圖2。

表3 3組卵母細胞行ICSI后受精、卵裂及胚胎發(fā)育情況

a:P<0.05，與PVP組比較

A：PVP組6-細胞Ⅱ級的胚胎；B：HSA組7-細胞Ⅱ級的胚胎；C：SPS組8-細胞Ⅱ級的胚胎

圖1 3組優(yōu)質胚胎的形態(tài)學評估(×200,10 μm)

A1：PVP組3BB期囊胚；A2：PVP組2期囊胚；B1：HSA組3BB囊胚；B2：HSA組2期囊胚；B3 和B4：HSA組1期囊胚；C1：SPS組3BB囊胚；C2：SPS組2期囊胚；C3：HSA組1期囊胚

圖2 3組囊胚的形態(tài)學評估

3 討 論

由于ICSI需要人為的把精子直接注入卵母細胞內，操作中的化學接觸不可避免地對卵母細胞造成一定程度的損害，其安全性尤其為人們所關注。PVP是一種人工合成的大分子聚合物，用作ICSI注射介質時，可以明顯降低因ICSI機械性損傷引起的卵子死亡，常用的PVP濃度為7%～10%。筆者的經驗是可以將PVP的濃度最低降至3.5%而不影響PVP的使用效果。HSA和SPS都屬于大分子物質，可以通過改變表面張力簡化對配子的操作，也可以起到與PVP相似的作用。PVP具有優(yōu)良的生理惰性和生物相容性，但是PVP被注射到卵胞質內后會包裹在精子周圍，使精子不容易釋放卵母細胞激活因子，卵母細胞使精核解聚的物質也不能作用于精核，致使精核不能解聚。而且，PVP本身的一些化學活性，可能會對ICSI后卵子受精以及受精卵的后續(xù)發(fā)育造成一定的影響。將人的精子與8.3%PVP共孵育30 min后作掃描電鏡，可以看見PVP造成精子頂體、細胞膜、和線粒體的膜特征被破壞，精子的核和染色質的形狀也會發(fā)生改變。在對山羊體外成熟卵母細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，PVP對山羊的卵母細胞具有毒性，與牛血清清蛋白(bovine serum albumin，BSA)相比較，PVP會明顯降低體外成熟卵母細胞的受精率和卵裂率[6-7]。KATO等[8]發(fā)現(xiàn)，10% 的PVP并不影響牛卵母細胞的受精率，但是，對受精卵的后續(xù)發(fā)育有影響，包括減少卵裂率、桑葚胚和囊胚形成率，所形成胚胎的卵裂球數(shù)目明顯減少，并且胚胎中40.9%的卵裂球中仍然可以檢測出PVP。YARI等[9]發(fā)現(xiàn)，精子暴露在PVP中可以影響受精卵的卵裂以及隨后的胚胎發(fā)育，并且以時間依賴的方式產生作用。PVP可誘導細胞周期的G2/M期阻滯以及活性氧自由基的形成，并由此誘導細胞凋亡。由此可見，PVP絕對不能視為完全無毒。本研究結果提示，雖然PVP組、HSA組和SPS組3組卵母細胞的受精率和正常受精率以及卵裂率無明顯差異，但HSA組和SPS組的卵裂率有高于PVP組的趨勢，并且PVP組細胞的優(yōu)質胚胎率顯著低于HSA組和SPS組，可見PVP對ICSI后受精卵的發(fā)育仍然具有不利的影響，本研究與大多數(shù)學者的研究結果一致。然而也有學者[10]報道，當PVP的濃度降低到ICSI可以操作的范圍之外時，會影響ICSI胚胎的后續(xù)發(fā)育，但是在不影響ICSI操作可控制性時，低濃度的PVP不會影響ICSI后胚胎的后續(xù)發(fā)育?？赡苁且驗樯鲜鰣蟮朗窃诓煌瑵舛鹊腜VP試驗組間的比較得出的結論，而本研究是在不影響ICSI操作可控制性時，對使用PVP和不使用PVP的結果進行比較。

目前輔助生殖技術中常用的培養(yǎng)基大分子物質添加劑為HSA或血清替代物[11]，如SPS。ISAJI等[11]采用BSA替代PVP作為鼠核移植的注射介質，結果表明，與PVP相比，BSA可以顯著提高克隆胚胎體外發(fā)育的速度，增加囊胚形成率，并且還增加了克隆小鼠后代的產量。相關機制研究發(fā)現(xiàn)BSA可以通過增加組蛋白H3 lysin9和組蛋白H4 lysin12的乙酰化水平來增強小鼠克隆胚胎的體外和體內發(fā)育。目前大多數(shù)的研究報道認為，人胚胎培養(yǎng)基內添加HSA或者SPS可以明顯提高人卵母細胞的受精率、胚胎發(fā)育、優(yōu)質胚胎率、囊胚形成率以及著床率[12-13]。本研究結果提示，在卵母細胞的受精率、正常受精率、卵裂率、優(yōu)質胚胎率以及囊胚形成情況等方面，HSA組和SPS組之間并未顯示明顯差異，說明HSA和SPS均可作為人卵母細胞的ICSI注射介質。此外，與常規(guī)IVF/ICSI周期以及正常臨床IVM方案獲得的未成熟卵母細胞相比，本研究中囊胚形成很少(繼續(xù)培養(yǎng)的156枚胚胎中，授精144 h時僅有9枚囊胚形成)，各組間無明顯的可比意義，考慮可能為本研究中采用的是常規(guī)促排卵周期中廢棄的未成熟卵母細胞，其在體內時就已經被優(yōu)勢卵泡中的卵母細胞所啟動的細胞抑制因子所作用，因此其發(fā)育潛能在采集時就已經降低，從而導致囊胚形成情況較差。

綜上所述，HSA和SPS作為ICSI注射介質后，可以取得與PVP相似的受精率、卵裂率和更好質量的胚胎，或可作為人ICSI的注射介質。值得注意的是，本試驗中所用到的患者捐贈的未成熟卵母細胞在常規(guī)IVF/ICSI-ET治療周期中的去向雖然多為丟棄，患者夫婦雙方也簽署了將其用于醫(yī)學科研的知情同意書，符合倫理原則，但是由于試驗產生的胚胎未能進行人體移植，所以胚胎的體內發(fā)育潛能并未得到證實，并且本研究樣本數(shù)量有限，所得結論可能具有一定的局限性，未來尚需要擴大樣本量并在倫理允許的條件下進行體內研究方可推廣應用。