單靜，常小靜，康曉靜，艾春梅，趙彥珺，萬騰騰，姜竹茂

（1.煙臺大學生命科學學院，山東煙臺264005；2.河南三劍客農(nóng)業(yè)股份有限公司，河南漯河462000）

0 引 言

羊奶作為一種比較獨特且又營養(yǎng)豐富的乳品資源，含有200多種營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性物質(zhì)，被稱為“奶中之王”，但由于其風味缺陷一直難以被消費者接受，嚴重制約了羊奶資源的開發(fā)利用[1-3]。牛羊奶混合發(fā)酵乳是以牛奶和羊奶為原料，在添加低聚果糖的基礎上由微生物發(fā)酵制成的一種高活菌型乳制品，具有更高的鈣含量及更強的保水能力[4]，明顯優(yōu)于僅有牛奶或羊奶發(fā)酵制備的發(fā)酵乳。且經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵后可以明顯改善羊奶風味，賦予混合發(fā)酵乳一種獨特口感，有益于推動羊奶市場的發(fā)展。

低聚果糖作為一種對多數(shù)益生菌增殖作用較明顯的益生元，可以促進乳品發(fā)酵，明顯縮短發(fā)酵時間，改善發(fā)酵乳的口感及穩(wěn)定性，并有效抑制腸道內(nèi)有害菌群的侵染定植，提高機體免疫力[5-10]。本文在添加低聚果糖的基礎上，研究各因素對牛羊奶混合發(fā)酵乳感官品質(zhì)的影響，進而生產(chǎn)出一種含有高活菌數(shù)新型發(fā)酵乳制品。

1 實驗

1.1 材料與試劑

牛奶，羊奶，保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌，低聚果糖，MRS固體培養(yǎng)基（自制），蔗糖等。

1.2 儀器與設備

CR J-0.03/60型均質(zhì)機，F(xiàn)A 1004型電子天平，EM-30型磁力攪拌水浴鍋，DNP-9082型電熱恒溫恒濕培養(yǎng)箱，SW-CJ-ID型超凈工作臺，ZBM 1380HPA型冰箱。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 高活菌型牛羊奶混合發(fā)酵乳制備要點

（1）牛羊奶混合比例的確定。牛羊奶分別以3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3的比例混合，添加7%的蔗糖與1.2%的低聚果糖，預熱均質(zhì)殺菌后，接種2.5%的發(fā)酵劑，于42℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵7 h，經(jīng)后熟處理后通過感官評價確定最佳混合比例。

（2）低聚果糖添加量的確定。由于低聚果糖對益生菌具有較好的增殖作用，可以明顯縮短發(fā)酵時間，改善發(fā)酵乳的風味。因此以牛羊奶混合比例2:1，蔗糖添加量7%，低聚果糖添加量（0，0.3%，0.6%，0.9%，1.2%，1.5%），預熱均質(zhì)殺菌后，接種2.5%的發(fā)酵劑，于42℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵7 h，經(jīng)過后熟處理后分析不同低聚果糖添加量對牛羊奶混合發(fā)酵乳感官品質(zhì)的影響以及在4℃條件下貯藏21 d內(nèi)活菌數(shù)的變化趨勢，并確定低聚果糖的最佳添加量。

1.3.3 單因素實驗

在其他因素不變的情況下，依次選取蔗糖添加量（3%，5%，7%，9%，11%）、菌種添加量（1%，1.5%，2%，2.5%，3%)、發(fā)酵時間(5 h，6 h，7 h，8 h，9 h)和發(fā)酵溫度（38℃，40℃，42℃，44℃，46℃）4個因素的不同水平進行單因素試驗。

1.3.4 評價方法

（1）感官評價：隨機選定10名（男女各半）有經(jīng)驗的品評員組成的感官評分小組。采用加權評分法[11]對產(chǎn)品的感官品質(zhì)進行綜合評定，根據(jù)產(chǎn)品組織狀態(tài)、色澤和風味等3項指標進行感官評價，滿分100分。各項指標所占分值及評定標準如表1所示。

（2）酸度測定：按照GB 5009.239-2016《食品酸度的測定》中酚酞指示劑法。

2 結果與分析

2.1 牛羊奶混合比例對牛羊奶混合發(fā)酵乳感官評分的影響

圖1 牛羊奶混合比例對牛羊奶混合發(fā)酵乳感官評分的影響

牛羊奶適宜的混合比例才能賦予發(fā)酵乳特有的醇厚風味，穩(wěn)定的組織狀態(tài)，以及細膩爽滑的口感。由圖1可知，當牛羊奶混合比在3∶1～2∶1范圍內(nèi)，感官評分升高，發(fā)酵乳的組織狀態(tài)越來越穩(wěn)定，特有的發(fā)酵乳風味越發(fā)顯著；當牛羊奶混合比為2∶1時，發(fā)酵乳的感官評分最高，此時呈現(xiàn)明亮的乳白色，酸味醇厚，爽滑適口；而當牛羊奶混合比在1∶1～1∶3范圍時，發(fā)酵乳凝乳狀態(tài)較差，羊膻味較強，感官評分下降，因此牛羊奶混合比例固定為2∶1。

2.2 低聚果糖添加量對牛羊奶混合發(fā)酵乳綜合評分的影響

圖2 低聚果糖添加量對牛羊奶混合發(fā)酵乳綜合評分的影響

表1 牛羊混合酸奶感官評價標準

圖3 不同低聚果糖添加量對貯存期牛羊奶混合發(fā)酵乳中活菌數(shù)的影響

（3）乳酸菌活菌數(shù)測定：按照GB 4789.35-2016《食品微生物檢驗》中M RS平板計數(shù)法。

由于低聚果糖自身有一定甜度，添加時需要先將

其與白砂糖復配調(diào)節(jié)到適當?shù)奶鸲群?，再加入發(fā)酵乳中發(fā)酵[7]。由圖2和圖3可知，隨著低聚糖添加量的增加，發(fā)酵乳的感官評分逐漸升高，而酸度的變化趨勢不顯著。當?shù)途厶翘砑恿繛?.2%時，發(fā)酵乳感官評分達到最高分。通過對不同低聚糖添加量貯存期內(nèi)牛羊奶混合發(fā)酵乳中活菌數(shù)的對比，可以明顯看出發(fā)酵乳在4℃，21 d內(nèi)，活菌數(shù)呈下降趨勢，但添加低聚果糖的發(fā)酵乳活菌數(shù)明顯高于對照組，其中添加1.2%低聚果糖的發(fā)酵乳在貯藏期一直保持較高的活菌數(shù)水平。當?shù)途酃翘砑恿窟^高時，可能是高濃度的低聚果糖在發(fā)酵乳中形成了高滲透壓，對乳酸菌產(chǎn)生一定的脫水作用而抑制了其生長[12]，因此固定低聚果糖的添加量為1.2%。

2.3 單因素試驗結果與分析

2.3.1 蔗糖添加量對牛羊奶混合發(fā)酵乳綜合評分的影響

圖4 蔗糖添加量對牛羊奶混合發(fā)酵乳綜合評分的影響

在發(fā)酵乳生產(chǎn)過程中添加蔗糖不僅可增加乳中干物質(zhì)含量，而且能有效促進凝乳，緩和酸度，提高口感質(zhì)量。適宜的蔗糖濃度可以促進乳酸發(fā)酵，但是蔗糖濃度過高時將會抑制整個發(fā)酵過程[13-14]。由圖4可知，隨著蔗糖添加量的增加，感官評分也隨之升高，當蔗糖添加量為7%時，發(fā)酵乳的感官評分最高，酸甜適口，口感最佳。當蔗糖添加量過多時，會造成發(fā)酵乳有甜膩感，感官評分也隨之降低。

2.3.2 菌種添加量對牛羊奶混合發(fā)酵乳綜合評分的影響

圖5 菌種添加量對牛羊奶混合發(fā)酵乳綜合評分的影響

由圖5可知，菌種添加量對牛羊奶混合發(fā)酵乳的感官評分以及酸度影響顯著。在牛羊奶混合發(fā)酵乳發(fā)酵過程中，兩菌1∶1混合能有效提高發(fā)酵速率，并且

保加利亞乳桿菌的產(chǎn)物對發(fā)酵乳的風味有很大的影響[15]。當菌種添加量為2.5%時，發(fā)酵乳的感官評分達到最高，此時具有較好的產(chǎn)黏特性以及適宜的酸度，組織狀態(tài)均勻穩(wěn)定，口感爽滑細膩，風味醇厚。當菌種添加量小于2.5%時，發(fā)酵乳的酸度隨菌種添加量的增加而增大，但為了使酸度和黏度達到要求，需要延長發(fā)酵時間，費時費力，造成額外損失。當菌種添加過量時，由于發(fā)酵初期凝乳較快，導致產(chǎn)酸加快同時凝乳中出現(xiàn)蛋白質(zhì)脫水收縮現(xiàn)象，致使乳清析出過多，產(chǎn)品組織粗糙，造成發(fā)酵乳質(zhì)量較差。

2.3.3 發(fā)酵時間對牛羊奶混合發(fā)酵乳綜合評分的影響

圖6 發(fā)酵時間對牛羊奶混合發(fā)酵乳綜合評分的影響

由圖6可知，在發(fā)酵過程中，由于奶中蛋白凝聚，使蛋白質(zhì)的三維網(wǎng)絡凝膠形成的程度越來越高，酸度逐漸增大，發(fā)酵乳凝固狀態(tài)也越來越好[16-17]。當發(fā)酵時間達到7 h時，發(fā)酵乳的組織狀態(tài)均勻細膩，酸甜比最佳，感官評分最高。隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵酸度在達到一定程度后，混合菌繼續(xù)產(chǎn)酸，部分酪蛋白溶解，使發(fā)酵乳中蛋白凝膠體受到破壞，導致黏度降低[18]。并且當發(fā)酵時間過長時，乳酸菌過度繁殖，使發(fā)酵乳產(chǎn)酸過快，易造成甜酸比失調(diào)，組織狀態(tài)不穩(wěn)定，乳清析出較多。因此，選擇合適的發(fā)酵時間可以使發(fā)酵乳中的蛋白形成良好的凝膠體，并維持適宜的酸度，獲得較好的感官品質(zhì)。

2.3.4 發(fā)酵溫度對牛羊奶混合發(fā)酵乳綜合品質(zhì)的影響

圖7 發(fā)酵溫度對牛羊奶混合發(fā)酵乳綜合品質(zhì)的影響

由圖7可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，牛羊奶混合發(fā)酵乳的感官品質(zhì)先升高后降低。當發(fā)酵溫度在38℃～42℃之間，發(fā)酵乳的產(chǎn)酸性和凝固性逐漸增強，并在42℃達到最高分，此時發(fā)酵乳的口感最佳，混合菌相互促進生長，凝乳狀態(tài)較好。高于42℃后，由于混合菌產(chǎn)酸性增強，發(fā)酵乳酸味過重，凝乳性較差，造成大量乳清析出。因此固定牛羊乳混合發(fā)酵乳的培養(yǎng)溫度為42℃。

2.4 響應面優(yōu)化試驗

2.4.1 響應面優(yōu)化方差分析

在單因素實驗的基礎上以及分析各因素對牛羊奶混合發(fā)酵乳發(fā)酵工藝影響的大小，采用Box-Behnken中心組合設計原理，以蔗糖添加量、菌種添加量和發(fā)酵時間為考察因素，牛羊奶混合發(fā)酵乳的感官評分（Y）為響應值，建立數(shù)學模型，以獲得其最佳發(fā)酵工藝條件。響應面試驗因素與水平編碼、Box-Behnken設計方案及響應值結果和Box-Behnken實驗方差分析如表2、表3、表4所示。

表2 響應面試驗因素與水平編碼

表3 Box-Behnken設計方案及響應值結果

對表3中進行處理，并進行多元回歸擬合，獲得感官評分(Y)對蔗糖添加量（A）、菌種添加量（B）和發(fā)酵時間（C）的二元多項回歸的擬合代碼方程為：Y=92.24+0.59A+0.17B-0.11C-0.18AB+0.15AC-0.98BC-2.24A2-2.17B2-1.49C2。

對回歸模型進行方差分析和顯著性檢驗，結果見表4。該方程的相關系數(shù)R2=0.9927，整體模型達到極顯著水平（P＜0.0001），失擬項不顯著（P=0.1773），說明回歸方程對實際情況具有良好的模擬度。回歸模型的校正系數(shù)R2adj=0.9833，說明98.33%的響應值變化可以用此模型進行有效的解釋。各項的P值表明，方程中A、BC、A2、B2、C2對響應值影響顯著（P＜0.05），影響大小順序為：A＞B＞C，即蔗糖添加量對產(chǎn)品的影響最大，其次是菌種添加量，發(fā)酵時間對產(chǎn)品的影響力最小。BC的P值小于0.01，說明菌種添加量和發(fā)酵時間對產(chǎn)品的影響存在交互作用極顯著。

表4 Box-Behnken實驗方差分析

2.4.2 響應面分析及工藝優(yōu)化

圖8 各因素交互作用的響應面圖

由圖8可知，蔗糖添加量、菌種添加量和發(fā)酵時間之間均存在一定的交互作用，其中菌種添加量和發(fā)酵時間交互作用顯著。當菌種添加量為最優(yōu)值時，發(fā)酵時間對感官評分的影響較為顯著。而發(fā)酵時間縮短或延長時，增加或減少菌種添加量均無法提高感官評分，主要是因為縮短發(fā)酵時間，不利于菌種的增殖，發(fā)酵乳無法達到最佳的酸度及風味。而延長發(fā)酵時間，致使發(fā)酵乳中蛋白凝膠體受到破壞,導致黏度降低，又因乳酸菌過度繁殖,使發(fā)酵乳產(chǎn)酸過快，易造成甜酸比失調(diào)，組織狀態(tài)不穩(wěn)定，乳清析出較多，導致感官評分下降。

2.4.3 最佳工藝條件的驗證

利用Design Expert V8.0.6軟件進行分析，得到牛羊奶混合發(fā)酵乳的最佳工藝參數(shù)為：蔗糖添加量為7.26%，菌種添加量為2.52%，發(fā)酵時間為6.95 h。為了驗證回歸模型的可靠性，同時考慮實際操作的可行性，對最佳工藝參數(shù)適當調(diào)整，即:蔗糖添加量為7.3%，菌種添加量為2.5%，發(fā)酵時間為7 h。并按此工藝進行3次平行試驗，得到發(fā)酵乳的感官評分為92.2分，與預測值92.3較為接近，表明該模型的擬合程度較高，并且在4℃條件下貯藏21 d后，發(fā)酵乳最大活菌數(shù)為7.7×107cfu/m L。

3 結論

研究確定了牛羊奶混合發(fā)酵乳中牛羊奶最佳混合比例為2∶1，低聚果糖添加量為1.2%，發(fā)酵溫度為42℃，并通過單因素試驗確定了發(fā)酵時間、蔗糖添加量和菌種添加量的水平，經(jīng)過Design-Expert.V8.0.6進行響應面試驗優(yōu)化牛羊奶混合發(fā)酵乳的最佳工藝配方為：蔗糖添加量為7.3%，菌種添加量為2.5%，發(fā)酵時間為7 h。在此條件下制備的酸奶口感醇厚，酸甜適口，風味獨特。在4℃條件下貯藏21 d后，發(fā)酵乳最大活菌數(shù)為7.7×107cfu/m L，為工業(yè)化生產(chǎn)高活菌型發(fā)酵乳提供技術支持，也為羊奶資源的開發(fā)利用拓寬了發(fā)展渠道。