吳勝澤，黃鐘標(biāo)，蘇煥斌，嚴(yán)家俊，劉輝

（廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，國家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（廣東），廣東佛山528300）

0 引 言

維生素B9又稱葉酸（folic acid），是一組功能和化學(xué)結(jié)構(gòu)與碟酰谷氨酸（pteroylglutam ic acid，PGA）相似的化合物的統(tǒng)稱，其廣泛存在于綠葉蔬菜中，是人體必不可少的營養(yǎng)物質(zhì)[1]。研究表明，維生素B9缺乏易引起習(xí)慣性流產(chǎn)、胎兒畸形、無腦兒、死胎、早產(chǎn)、胚胎停育等非正常妊娠的產(chǎn)生。同時(shí)也與新生兒白血病等癌癥，以及兒童智力低下有關(guān)[2]。而攝入過量維生素B9會(huì)產(chǎn)出毒副作用，如神經(jīng)受損、發(fā)育緩慢、降低食欲等。因此，對(duì)嬰幼兒乳粉中維生素B9含量的控制極其重要?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn)嬰兒配方食品》（GB 10765—2010）明確規(guī)定嬰兒配方奶粉中維生素B9標(biāo)準(zhǔn)含量為（2.5～12.0）μg/100 k J[3]，《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)較大嬰兒和幼兒配方食品》（GB 10767—2010）也規(guī)定較大嬰兒和幼兒配方奶粉中維生素B9含量為≥1μg/100 k J[4]。

目前測(cè)定維生素B9的方法包括：比色法、高效液相色譜法、微生物法、同位素放射免疫法等。其中微生物法由于其成本低，靈敏度較高而成為許多國際機(jī)構(gòu)的首選方法[5]，中國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB5413.16—2010也將生物法作為維生素B9檢測(cè)的首選方法[6]。然而國家標(biāo)準(zhǔn)方法存在操作過程繁瑣，準(zhǔn)確度較低、重復(fù)性較差等缺點(diǎn)。而試劑盒法因其操作簡(jiǎn)單、快速靈敏等優(yōu)點(diǎn)，能夠廣泛應(yīng)用于嬰幼兒乳品的檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

VitaFast?Folic Acid維生素B9試劑盒。試劑盒的組成（96孔微孔板，包被有Lactobacillus rhamnosus，無菌蒸餾水，固態(tài)維生素B9培養(yǎng)基，固態(tài)維生素B9標(biāo)準(zhǔn)品，貼合箔，微孔板框）。

無菌離心管（1.5 m L，50 m L），移液器，37℃恒溫培養(yǎng)箱，95℃水浴鍋，MULTISKAN M K3酶標(biāo)儀，高速離心機(jī)，G&G電子天平，渦旋振蕩器。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

精確稱取1.0 g樣品于50 m L離心管中，加入40 m L無菌蒸餾水，利用渦旋振蕩器混勻，95℃水浴提取30 min，提取時(shí)須至少振蕩5次，迅速冷卻至室溫，離心（8 000 r/m in，5 min），取200μL上清液于1.5 m L離心管中，稀釋備用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

打開固態(tài)維生素B9標(biāo)準(zhǔn)品瓶，按說明書要求加入適量無菌蒸餾水（取自試劑盒），蓋上標(biāo)準(zhǔn)品瓶蓋，搖勻稀釋制得標(biāo)準(zhǔn)品原液。

取6個(gè)1.5m L離心管，按表1準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每組做2個(gè)平行。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制方法

1.2.3 維生素B9培養(yǎng)基的配制

打開固態(tài)維生素B9培養(yǎng)基瓶取出干燥劑，加入10 m L無菌蒸餾水（取自試劑盒），加入1 m L維生素B9緩沖液。蓋上瓶蓋，利用渦旋振蕩器混勻，95℃水浴加熱5 min，期間至少振蕩2次，迅速冷卻至室溫，備用。

1.2.4 檢測(cè)過程

按實(shí)驗(yàn)需求取出一定數(shù)量的微孔板固定于微孔板框中。使用移液器移取維生素B9培養(yǎng)基150μL/孔，移取150μL標(biāo)準(zhǔn)品或稀釋的樣品至指定的微孔中。

除去粘合箔上的保護(hù)層，將其平放在微孔條上，用手將粘合箔平壓，使其充分封閉微孔板條。在37℃黑暗條件下孵育44～48 h。孵育結(jié)束后，再次壓緊粘合箔，將微孔板翻置在桌面，在桌面平面上振蕩，是微生物溶解在培養(yǎng)基中。撕開粘合箔，用移液管尖除去液體表面的泡沫，用酶標(biāo)儀610～630 nm（或540～550 nm）條件下讀取吸光度A。

1.3 定量分析方法

使用試劑盒專用的分析軟件（R IDA?SOFT W in）對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。該試劑盒標(biāo)示靈敏度為0.18μg/kg，變異系數(shù)小于10%。最終檢測(cè)結(jié)果應(yīng)以實(shí)際測(cè)定的吸光度，并將對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)換算后得出。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以維生素B9標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1所示。

圖1 維生素B9標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取5種不同配方的奶粉進(jìn)行檢測(cè)，每種奶粉做5次平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。由表2可知，5種不同配方的奶粉5次平行實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%）在1.90%～4.49%之間。

表2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 μg/100g

2.3 回收率實(shí)驗(yàn)

選取已知維生素B9質(zhì)量分?jǐn)?shù)的配方奶粉，取樣并加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示，由表3可知，加標(biāo)實(shí)驗(yàn)的回收率在95.60%～102.98%之間。

表3 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 討論

為避免外來微生物對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，實(shí)驗(yàn)過程應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行。標(biāo)準(zhǔn)溶液?？瞻讓?duì)照、稀釋樣品應(yīng)進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)以避免偶然因素對(duì)結(jié)果的影響。樣品稀釋后維生素B9濃度應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。

3 結(jié)論

本研究采用試劑盒法測(cè)定嬰幼兒配方奶粉中維生素B9的含量，由重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，對(duì)5種不同配方的奶粉5次平行實(shí)驗(yàn)的RSD%在1.90%～4.49%之間。由加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)可知，加標(biāo)實(shí)驗(yàn)的回收率在95.60%～102.98%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%）為2.89%。說明該方法重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度較高，適用于嬰幼兒配方奶粉中維生素B9的檢測(cè)。該方法與食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5413.16—2010相比，在保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的同時(shí)，具有操作步驟簡(jiǎn)單、檢測(cè)周期短、消除了菌種在保存和傳代過程中造成的誤差等優(yōu)點(diǎn)。該方法可以快速有效的測(cè)定嬰幼兒乳品中的維生素B9含量，有利于實(shí)驗(yàn)室對(duì)嬰幼兒乳品中維生素B9的檢驗(yàn)與研究。