關(guān)丫丫，梁銀明，王 輝，葉建平，3

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.河南省分子診斷與醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 新鄉(xiāng) 453003；3.美國路易斯安那州立大學(xué)Pennington生物醫(yī)學(xué)中心，路易斯安那州 巴吞魯日市 70808)

三磷腺苷合酶抑制因子1(adenosine triphosphate synthase inhibitory factor 1，ATPIF1)是與三磷腺苷(adenosine triphosphate，ATP)合酶相互作用的由細(xì)胞核編碼產(chǎn)生的線粒體蛋白[1]。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，ATPIF1與ATP合酶的F1區(qū)相互作用[2]，主要抑制ATP合酶的水解活性。但目前有研究表明，ATPIF1也能抑制ATP合酶的合成活性[1]。ATPIF1的活性在生理?xiàng)l件下受能量供需關(guān)系的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)[3]。在能量需求高的細(xì)胞如小鼠心肌細(xì)胞中，大部分ATPIF1處于失活狀態(tài)。在牛心肌線粒體中，ATPIF1蛋白單體無活性，無法與ATP合酶F1區(qū)結(jié)合；當(dāng)ATPIF1蛋白形成同源二聚體時(shí)被活化，產(chǎn)生抑制ATP合酶的作用[4]。目前，關(guān)于小鼠ATPIF1基因表達(dá)的研究較少，在能量代謝方面的表型研究更少。有研究顯示，ATPIF1基因敲除小鼠的體質(zhì)量和體脂量均降低，提示ATPIF1敲除可能對(duì)代謝產(chǎn)生影響[5]。此外，在肥胖和2型糖尿病患者骨骼肌中ATPIF1表達(dá)增加，提示ATPIF1可能影響脂質(zhì)代謝[6]。還有研究表明，ATPIF1基因參與胰島素分泌的負(fù)調(diào)控機(jī)制，抑制胰腺β細(xì)胞對(duì)葡萄糖的反應(yīng)[7]。在大多數(shù)人類常見腫瘤中，ATPIF1基因過表達(dá)，使氧化磷酸化轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒?，促進(jìn)了腫瘤進(jìn)展[8]。但ATPIF1基因敲除對(duì)脂肪細(xì)胞分化的影響還未見報(bào)道。本研究通過比較ATPIF1敲除小鼠和野生型小鼠白色脂肪細(xì)胞在體外分化的差異，探討ATPIF1敲除對(duì)脂肪細(xì)胞分化的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取5只ATPIF1基因敲除小鼠作為觀察組，另取5只C57BL/6小鼠作為對(duì)照組，小鼠體質(zhì)量22～24 g，所有小鼠均由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，飼養(yǎng)于濕度40%～50%、溫度(24.0±1.0)℃的獨(dú)立通氣籠系統(tǒng)，晝夜比為 12 h12 h。給小鼠喂食低脂飼料，其中粗脂肪含量≥4%，粗蛋白質(zhì)含量≥20.5%，粗纖維含量≤5%。

1.2主要試劑與儀器達(dá)爾伯克改良伊戈?duì)柵囵B(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM)購自美國HyClone公司，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自美國Gibco公司，胰島素干粉、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX)、地塞米松、吡格列酮和吲哚美辛購自美國Sigma公司，Ⅰ型膠原酶購自美國Worthington公司，中性蛋白酶Ⅱ購自瑞氏Roche公司，ATP檢測(cè)試劑盒購自美國Thermo Fisher公司，低脂飼料購自上海普路騰生物科技有限公司，三酰甘油(triacylglycerol，TG)檢測(cè)試劑盒購自南京建成公司。酶標(biāo)儀購自美國Molecular Devices公司，4 ℃低溫離心機(jī)購自美國Beckman Coulter公司。

1.3溶液配置

1.3.1消化液配制50 mL的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solation,PBS)中加入40 mg 的Ⅰ型膠原酶和125 mg中性蛋白酶Ⅱ，放入37 ℃水浴器中過夜，待完全溶解后，用0.22 μmol·L-1的濾器過濾，分裝后-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2白色脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)劑Ⅰ配制50 mL 33 mmol·L-1完全培養(yǎng)基中加入1.73 mmol·L-1胰島素50 μL、0.5 mmol·L-1IBMX 50 μL、1 mmol·L-1地塞米松50 μL、2 mmol·L-1吲哚美辛5 μL、10 mmol·L-1吡格列酮 5 μL，混勻后4 ℃冰箱保存。

1.3.3白色脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)劑Ⅱ配制50 mL 33 mmol·L-1完全培養(yǎng)基中加入1.73 mmol·L-1胰島素50 μL，混勻后4 ℃冰箱保存。

1.4細(xì)胞收集與培養(yǎng)異氟烷麻醉并處死2組小鼠，剪下耳組織，體積分?jǐn)?shù)75%乙醇消毒3次，PBS將耳組織上殘留的乙醇沖洗干凈，在超凈工作臺(tái)內(nèi)將耳組織剪成1 mm左右的碎塊，將碎塊收集到 15 mL 離心管中，加入3 mL消化液；37 ℃水浴器中消化2 h，在此期間每5 min搖晃離心管1次，使組織碎塊與消化液充分接觸。加入3 mL完全DMEM終止消化作用，1 500 r·min-1離心5 min，棄上清液；再加入 1 mL 完全DMEM重懸細(xì)胞，1 500 r·min-1離心 5 min，棄上清液。最后，加入 1 mL 完全DMEM重懸細(xì)胞沉淀，將細(xì)胞懸液移入10 cm 的細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。細(xì)胞傳代1～2次后，待細(xì)胞長(zhǎng)滿再接觸抑制3 d左右，更換含白色脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)劑Ⅰ的細(xì)胞培養(yǎng)基誘導(dǎo)4 d，再更換含白色脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)劑Ⅱ的培養(yǎng)基誘導(dǎo)4 d。在誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)4、8 d分別檢測(cè)成纖維細(xì)胞內(nèi)ATP和TG水平。

1.5成纖維細(xì)胞中ATP水平檢測(cè)將6孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于冰上，用預(yù)冷的PBS洗2次，每孔中加入細(xì)胞裂解液120 μL，用細(xì)胞刮收集成纖維細(xì)胞至1.5 mL的小離心管中，冰上放置30 min，用組織破碎儀將細(xì)胞充分破碎，4 ℃ 12 000×g離心10 min，取上清液。如果細(xì)胞裂解后TG較多，離心以后可以看到上層漂浮有大量的油脂，小心去除油脂，取上層清液，必要時(shí)重復(fù)離心1～2次，直至上層清液中沒有油脂層。采用ATP檢測(cè)試劑盒測(cè)成纖維細(xì)胞中ATP水平，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6成纖維細(xì)胞中TG水平檢測(cè)在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板的每個(gè)孔中加入500 μL胰蛋白酶消化液，放置37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱30 s，小心吸出胰蛋白酶消化液，PBS洗2次，緩慢清洗不要使細(xì)胞脫落，加入100 μL體積分?jǐn)?shù)2% TritonX-100稀釋液，冰上放置30 min，用組織破碎儀將細(xì)胞充分破碎；采用TG檢測(cè)試劑盒檢測(cè)成纖維細(xì)胞中TG水平，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.12組小鼠成纖維細(xì)胞中ATP水平比較結(jié)果見表1。誘導(dǎo)前，對(duì)照組小鼠原代成纖維細(xì)胞中ATP水平明顯低于觀察組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；誘導(dǎo)4、8 d，對(duì)照組與觀察組小鼠原代成纖維細(xì)胞中ATP水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 2組小鼠原代成纖維細(xì)胞中ATP水平比較Tab.1 Comparison of the ATP level in fibroblasts of mice between the two groups

2.22組小鼠成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)過程中TG水平比較結(jié)果見圖1和表2。誘導(dǎo)4、8 d，對(duì)照組小鼠成纖維細(xì)胞中TG水平低于觀察組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A：對(duì)照組；B：觀察組。

表2 2組小鼠成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)過程中TG水平比較Tab.2 Comparison of the TG level in fibroblasts of mice between the two groups

3 討論

ATPIF1是線粒體ATP合酶的內(nèi)生性抑制蛋白，其與ATP合酶結(jié)合以后，可以抑制ATP合酶的合成和水解作用[9-12]。NAKAMURA等[13]研究了ATPIF1基因敲除純合子小鼠在正常飲食條件下的生長(zhǎng)發(fā)育情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ATPIF1基因敲除純合子小鼠的體質(zhì)量和體脂量與野生型小鼠相比無明顯差異，線粒體超微結(jié)構(gòu)、自噬、代謝產(chǎn)物以及細(xì)胞內(nèi)ATP水平也無明顯變化。而歐洲條件性基因突變鼠組織培育了ATPIF1基因敲除小鼠，正常飲食后發(fā)現(xiàn)該小鼠在脂肪組織、代謝穩(wěn)態(tài)、生長(zhǎng)發(fā)育及體型上是有改變的[1]。由于ATPIF1基因敲除的表型還不清楚，而且關(guān)于ATPIF1基因敲除對(duì)脂肪細(xì)胞分化的影響還未見報(bào)道。因此，本研究將ATPIF1基因敲除小鼠的原代成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞，觀察ATPIF1基因敲除對(duì)脂肪細(xì)胞分化過程中成纖維細(xì)胞中ATP水平的影響以及對(duì)脂肪細(xì)胞分化的影響。

ATPIF1基因是ATP合酶的雙向抑制劑，可以抑制ATP合酶的合成和水解ATP的功能。ATPIF1可選擇性抑制ATP合酶的水解活性，比如在心臟缺血時(shí)，ATPIF1抑制ATP合酶的水解活性，維持心肌細(xì)胞內(nèi)ATP水平，保護(hù)心臟[14]。在轉(zhuǎn)基因小鼠中，神經(jīng)元和肝細(xì)胞中表達(dá)活化型ATPIF1(H49K突變蛋白)，抑制ATP合酶的合成活性，使細(xì)胞內(nèi)ATP水平降低[15-16]。本研究結(jié)果表明，ATPIF1基因敲除提高了成纖維細(xì)胞中線粒體的活性，促進(jìn)了成纖維細(xì)胞內(nèi)ATP的合成，而ATP的增加也促進(jìn)了脂肪細(xì)胞的分化。ATP是細(xì)胞生理活動(dòng)所需能量的直接來源，成纖維細(xì)胞被誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞的過程需要消耗ATP。隨著誘導(dǎo)的進(jìn)展，脂肪細(xì)胞數(shù)目逐漸增多，儲(chǔ)存TG的量逐漸增加，導(dǎo)致線粒體的數(shù)量和合成的ATP減少。在脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)過程中，ATPIF1基因敲除小鼠成纖維細(xì)胞中高水平的ATP逐漸降低，促進(jìn)了脂肪細(xì)胞分化。

綜上所述，ATPIF1基因敲除促進(jìn)了成纖維細(xì)胞中ATP的合成，并且促使成纖維細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞，儲(chǔ)存更多的TG。本實(shí)驗(yàn)通過成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞，首次驗(yàn)證了ATPIF1基因敲除對(duì)脂肪細(xì)胞分化的影響。