閻春蘭 央青卓瑪 韋英美 王濤 雷世庭 王磊

摘要：采用革蘭氏染色技術(shù)、生理生化試驗(yàn)和16S rDNA序列分析，對(duì)分離篩選自土壤中的抗藥菌株進(jìn)行鑒定；測(cè)定菌株的生長(zhǎng)曲線了解菌株的生長(zhǎng)情況；耐藥性和抑菌性試驗(yàn)檢測(cè)菌株的特性。結(jié)果表明，從土壤中分離得到11種抗藥菌株，經(jīng)鑒定為假單胞菌屬（Pseudomonas）、貪噬菌屬（Variovorax）、溶桿菌屬（Lysobacte）和短芽孢桿菌屬（Brevibacillus）等。其中，菌株XC-10、XN-4、XN-5和XN-6等分別對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和藤黃微球菌（Micrococcus luteus）等細(xì)菌的生長(zhǎng)有不同程度的抑制作用；11種菌株分別對(duì)終濃度為10 μg/mL壯觀霉素和20 μg/mL氨芐青霉素等具有顯著的耐藥性。

關(guān)鍵詞：抗藥菌株；分離鑒定；16S rDNA；抑菌特性

中圖分類號(hào)：Q93-331 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2018）10-0060-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.10.014

Isolation，Identification and Antimicrobial Traits of Antibiotic

Resistant Strains in Environment

YAN Chun-lan，YANG-QING Zhuo-ma，WEI Ying-mei，WANG Tao，LEI Shi-ting，WANG Lei

（College of Life Sciences，South-Central University for Nationalities，Wuhan 430074，China）

Abstract： By using Gram stain， physiological property and phylogenetic trees based on 16S rDNA，the different antibiotic resistant strains which were screened and isolated from soil were identified. Then the growth chart of strains were measured，and the drug resistance and the antimicrobial characteriatics were detected. The results showed that 11 antibiotic resistant strains were isolated and identified from soil. According to morphological characteristics and the phylogenetical analysis of 16S rDNA，these strains were determined to belong to Pseudomonas， Variovorax， Lysobacte and Brevibacillus. And the strains of XC-10，XN-4，XN-5 and XN-6 had different inhibitory effects on the growth of bacteria such as Staphylococcus aureus，Bacillus subtilis，and Micrococcus luteus. Screened had obvious inhibiting effect on six common indicator strains. The 11 strains all showed significant drug-resistance to the final concentration of 10 μg/mL spectinomycin and 20 μg/mL ampicillin.

Key words： antibiotic resistant strains； isolation and identification； 16S rDNA； antimicrobial characteriatics

抗生素是在動(dòng)植物或者微生物上提取的能夠殺滅病菌的代謝產(chǎn)物[1]，是人類對(duì)抗細(xì)菌感染的有效手段。近些年來，傳統(tǒng)的放線菌、鏈霉菌和少數(shù)細(xì)菌產(chǎn)生的抗生素已不能對(duì)抗大部分病原菌[2]，細(xì)菌耐藥性問題越來越受到人們關(guān)注[3，4]，而有些細(xì)菌天然的對(duì)一種以上的藥物具有耐受性[5]，出現(xiàn)了大量的超級(jí)細(xì)菌如耐青霉素肺炎菌（Penicillin-resistant Streptococcus pneumonia，PRSP）、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）和耐萬古霉素腸球菌（Vancomycin-resistant Enterococcus，VRE）等[6，7]。針對(duì)目前耐藥性日益嚴(yán)重的問題，除繼續(xù)開發(fā)傳統(tǒng)的抗生素外，也進(jìn)行了新型的抗耐藥菌抗生素的研發(fā)，尤其是一些新結(jié)構(gòu)類別抗生素和（半）合成抗生素的研究開發(fā)[8]，以及非抗生素療法，如噬菌體及噬菌體裂解酶療法[9]、CRISPR-Cas9等的應(yīng)用[10]。也有研究表明，細(xì)菌產(chǎn)生的細(xì)菌素，與其他的細(xì)菌素、抗生素、噬菌體裂解酶或者其他的抗微生物藥物結(jié)合，可以用于防治病原菌[11]。本研究自青海西寧污水區(qū)和四川西昌醫(yī)院附近的土壤中分離篩選抗藥性菌株，初步了解其培養(yǎng)特征、形態(tài)特征，通過16S rDNA序列分析及生理生化試驗(yàn)鑒定菌株。檢測(cè)菌株的耐藥性和抑菌性，為尋找高效新型抗菌藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)篩菌土樣采集于青海西寧污水區(qū)的土壤，以及四川西昌醫(yī)院附近的土壤。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，pH 7.0～7.2，瓊脂粉15～20 g，去離子水補(bǔ)充至1 000 mL。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母浸出物5 g，NaCl 10 g，pH 7.0～7.2，瓊脂粉15～20 g，去離子水補(bǔ)充至1 000 mL。

1.2 抗藥性菌株的篩選、純化與鑒定

稱取10 g采集到的土樣，加入至90 mL含有玻璃珠的無菌水中，200 r/min振蕩15～20 min。吸取1 mL振搖后的液體，加入至含有9 mL無菌水的試管中，混勻，進(jìn)行梯度稀釋。分別吸取0.1 mL 10-3、10-4、10-5、10-6稀釋度的液體，均勻涂布到含終濃度為50 μg/mL氨芐青霉素（記為Ap50）和終濃度為10 μg/mL卡那霉素（記為Km10）的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，37 ℃條件下培養(yǎng)48 h。挑取形態(tài)特別、生長(zhǎng)良好的單菌落，劃線于Ap50或Km10牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，依此挑取單菌落劃線純化5～6次，以獲得純化的抗藥性菌株。

將上述純化得到的單菌落，接種于Ap50或Km10牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48～64 h。進(jìn)行革蘭氏染色，以確定菌株類別。在光學(xué)顯微鏡下觀察菌株大小、顏色和形態(tài)等特征。

挑取上述純化后的單菌落，進(jìn)行生理生化試驗(yàn)。生理生化指標(biāo)[12]包括吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、伏普試驗(yàn)和檸檬酸鹽試驗(yàn)。

提取菌株總DNA[13，14]。參照文獻(xiàn)[13]的方法擴(kuò)增菌株16S rDNA。用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（AxyPrep，杭州，中國(guó)）純化回收16S rDNA產(chǎn)物。將純化后的16S rDNA與克隆載體pMD18-T于16 ℃條件下連接12 h，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，均勻涂布至含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃條件下培養(yǎng)16 h。挑取陽性克隆，送至天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序得到的16S rDNA序列與NCBI中已知菌株的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)，使用Mega 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3 菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將上述純化得到的菌株接種至5 mL Ap50或Km10牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h。按照5%接種量接種上述細(xì)菌母液至5 mL Ap50或Km10牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，依次培養(yǎng)0、2、4、8、12、16、20、24或36 h。待培養(yǎng)結(jié)束后，于600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定菌液吸光度。

1.4 細(xì)菌耐藥性試驗(yàn)

將上述純化得到的菌株分別接種至含有終濃度分別為2 μg/mL的四環(huán)素（記為Tc2）、20 μg/mL的氨芐青霉素（記為Ap20）、20 μg/mL的卡那霉素（記為Km20）、5 μg/mL的慶大霉素（記為Gm5）、50 μg/mL的鏈霉素（記為St50）、10 μg/mL壯觀霉素（記為Sp10）、2 μg/mL的氯霉素（記為Cm2）的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中，于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h或48 h，觀察菌落生長(zhǎng)情況。

1.5 細(xì)菌抑菌性試驗(yàn)

細(xì)菌的抑菌性試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[15]進(jìn)行，挑取上述純化的單菌落分別接種至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h，吸取上述各菌液100 μL，加入至涂布有大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、藤黃微球菌（Micrococcus luteus）、嗜線蟲沙雷氏菌（Serratia nematodiphila）和產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）（作為指示菌）的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上的牛津杯中，于37 ℃條件下培養(yǎng)24～48 h，觀察菌落生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離及鑒定

分離篩選得到11株抗藥性菌株，依次命名為XC-1、XC-2、XC-4、XC-7、XC-10、XC-11、XN-1、XN-4、XN-5、XN-6和XN-9。11株菌株具體形態(tài)特征如表1所示，菌落顏色為黃色或乳白色；除菌株XC-4、XC-11和XN-6菌落表面凹陷或皺縮外，其余菌株的菌落表面光滑。除菌株XC-7和XN-9為球狀外，其他菌株形態(tài)為短桿狀或長(zhǎng)桿狀；此外，菌株XC-11、XN-1和XN-4具有芽孢結(jié)構(gòu)，其他8種菌株均無芽孢。革蘭氏染色結(jié)果表明，菌株XC-1、XC-4、XC-7、XN-1、XN-6和XN-9為革蘭氏陽性菌，其他菌株均為革蘭氏陰性菌。生理生化試驗(yàn)表明，這11種菌株的吲哚試驗(yàn)和伏普試驗(yàn)均呈陰性，除菌株XC-7和XN-1外，其他菌株的甲基紅試驗(yàn)均為陰性。此外，除菌株XC-11外，其他菌株的檸檬酸鹽試驗(yàn)均為陰性。

將11種菌株的16S rDNA序列上傳至NCBI中，與已知菌株的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖1所示。由圖1、表2可知，菌株XC-1的16S rDNA序列與纖維單胞菌屬的16S rDNA序列（登錄號(hào)：NR_119095.1）相似性達(dá)98%，且兩者處于系統(tǒng)進(jìn)化樹的同一分支上?；谛螒B(tài)學(xué)觀測(cè)、生理生化試驗(yàn)及16S rDNA序列分析可知，菌株XC-1屬于纖維單胞菌屬，其他10種菌株被鑒定為假單胞菌屬和短芽孢桿菌屬等。

2.2 菌株生長(zhǎng)情況的測(cè)定

如圖2所示，11株菌株在0～4 h，生長(zhǎng)緩慢，處于延滯期；在4～16 h，菌株均快速繁殖，處于對(duì)數(shù)期；到16 h后，11種菌株的生物量基本達(dá)到最大值，到24 h后，OD600 nm減小，菌株進(jìn)入衰亡期。根據(jù)11種菌株的生長(zhǎng)曲線，可選取16 h后的菌株作為起始菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

2.3 菌株的耐藥性檢測(cè)

使用四環(huán)素和氨芐青霉素等7種抗生素對(duì)11種菌株進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，由表3可知，耐藥性處理24和48 h后，各菌株的生長(zhǎng)情況基本不變；20 μg/mL卡那霉素（Km20）對(duì)菌株XN-1的生長(zhǎng)具有抑制作用，對(duì)菌株XC-2、XC-7、XC-11的生長(zhǎng)具有較弱的影響，而菌株XC-4、XC-1、XC-10、XN-4、XN-5、XN-6對(duì)Km20有較強(qiáng)的耐藥性；5 μg/mL慶大霉素（Gm5）對(duì)菌株XN-1的生長(zhǎng)具有抑制作用，對(duì)XC-4、XN-4、XN-5、XN-6、XN-9菌株的生長(zhǎng)具有較弱的影響，而菌株XC-1、XC-7、XC-11對(duì)Gm5有較強(qiáng)的耐藥性；50 μg/mL鏈霉素（St50）對(duì)菌株XC-1、XC-2、XN-1和XN-5的生長(zhǎng)均具有抑制作用；此外，11種菌株分別對(duì)10 μg/mL壯觀霉素（Spe10）和20 μg/mL氨芐青霉素（Amp20）呈現(xiàn)不同程度的耐藥性。菌株XN-1除對(duì)Spe10和Amp20具有耐藥性外，對(duì)其余檢測(cè)的抗生素均不具有耐藥性。

2.4 菌株的抑菌性檢測(cè)

篩選純化得到的11種菌株對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、藤黃微球菌、嗜線蟲沙雷氏菌和產(chǎn)氣腸桿菌（作為指示菌）生長(zhǎng)的抑制作用如表4所示。XC-1、XC-2、XC-4、XC-7、XC-11、XN-1和XN-9的代謝產(chǎn)物對(duì)6種指示菌的生長(zhǎng)均沒有抑制作用。此外，菌株XC-10、XN-4、XN-5和XN-6的代謝產(chǎn)物能不同程度地抑制部分指示菌的生長(zhǎng)。其中，菌株XN-5的代謝產(chǎn)物對(duì)所有指示菌的生長(zhǎng)均具有抑制作用。

3 小結(jié)與討論

從土壤中分離得到11種抗藥菌株，經(jīng)鑒定為假單胞菌屬（Pseudomonas）、貪噬菌屬（Variovorax）、溶桿菌屬（Lysobacte）和短芽孢桿菌屬（Brevibacillus）等。鏈霉菌屬、枯草芽孢桿菌屬和假單胞菌屬等是常見的能夠產(chǎn)生抗生素的微生物[16-18]，同屬的菌株在形態(tài)特征和生理生化特性等方面往往會(huì)有相似之處。已有的研究結(jié)果可以為進(jìn)一步研究已鑒定種類的微生物的抗菌特性等提供線索[19]。

在檢測(cè)中，11種菌株中有10株，即分離到的菌株中有90.91%的菌株，對(duì)6種以上的抗生素具有不同程度的耐藥性，占到檢測(cè)抗生素的85.71%，表明自然環(huán)境中菌株的多種耐藥性已非常嚴(yán)重，與前人的研究結(jié)果一致[20]。細(xì)菌耐藥性，尤其多重耐藥性的產(chǎn)生是一個(gè)世界性的公共衛(wèi)生難題[21，22]，加大了抗感染治療的難度，如大腸埃希氏菌和肺炎克雷伯菌等對(duì)碳青霉烯類等抗生素的耐藥率較高[23]。本研究中的多個(gè)菌株對(duì)各種不同抗生素均呈現(xiàn)不同的耐藥性，為后期探索菌株中抑菌性物質(zhì)與抗生素的結(jié)合用于防治病原菌奠定了基礎(chǔ)。

XC-10、XN-4、XN-5和XN-6為分別來源于不同菌屬的細(xì)菌，包括貪噬菌屬（Variovorax）、劍菌屬（Ensifer）、蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）和短芽孢桿菌屬（Brevibacillus）。這些細(xì)菌能夠明顯抑制常見微生物的生長(zhǎng)，但其機(jī)制不明，因此分離純化這些抗藥菌株代謝產(chǎn)物中的有效成分，并將其與抗生素相結(jié)合，應(yīng)用于病原菌的防治等，均有待進(jìn)一步的研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王其田，王淑紅，朱 冰，等.回顧性分析解放軍534醫(yī)院抗生素合理使用情況[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志，2011，27（2）：152-153，155.

[2] 褚福鑫，白志強(qiáng)，朱紅惠.微生物中抗耐藥菌活性天然產(chǎn)物的研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2015（27）：1466-1482.

[3] 張麗芳.細(xì)菌的耐藥性[J].河北化工，2011，34（8）：40-41，43.

[4] HOLMES A H，MOORE L S，SUNDSFJORD A，et al. Understanding the mechanisms and drivers of antimicrobial resistance[J].Lancet，2016，387（10014）：176-187.

[5] TENOVER F C. Mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria[J].Am J Infect Control，2006，34（S1）：3-10.

[6] 劉云紅.臨床常見耐藥性細(xì)菌的耐藥機(jī)制[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2009，11（6）：129-130.

[7] 趙 捷，于麗婧，王佳慶.臨床常見耐藥菌的治療策略[J].藥品評(píng)價(jià)，2014，11（10）：19-22.

[8] 陳代杰.新世紀(jì)以來全球新型抗菌藥物研發(fā)及前沿研究進(jìn)展[J].中國(guó)抗生素雜志，2017，42（3）：161-168.

[9] WONG W F，SANTIAGO M. Microbial approaches for targeting antibiotic-resistant bacteria[J].Microb Biotechnol，2017，10（5）：1047-1053.

[10] 姚文曄，曾 潔，薛云新，等.細(xì)菌耐藥性及新型抗菌療法研究進(jìn)展[J].中國(guó)抗生素雜志，2017，42（5）：321-327.

[11] MATHUR H，F(xiàn)IELD D，REA M C，et al. Bacteriocin-antimicrobial synergy：A medical and food perspective[J].Frontiers in Microbiology，2017，8：1-18.

[12] 沈 萍，陳向東.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京：高等教育出版社，2007.

[13] 閻春蘭，李 娜，敖偲成，等.啤酒廠廢水處理活性污泥中一株細(xì)菌的分離與鑒定[J].中南民族大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2017， 36（1）：21-23.

[14] 姜淑梅，張 龍，戴世鯤，等.一種簡(jiǎn)單、有效的適于PCR操作的放線菌DNA提取方法[J].生物技術(shù)，2007，17（1）：39-41.

[15] 李 剛，傅玲琳，王彥波.益生菌凝結(jié)芽孢桿菌胞外產(chǎn)物抑菌特性研究[J].食品科技，2013，38（10）：20-24.

[16] 謝云英，許鴻章，俞 瑩，等.尿甘肽類微生物sansanmycin D的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定[J].中國(guó)抗生素雜志，2009，34（6）：326-328.

[17] 蓋婷婷，宋學(xué)鳴，錢秀萍，等.一株抗萬古霉素耐藥菌的抗生素產(chǎn)生菌AR1148的鑒定[J].工業(yè)微生物，2005，35（3）：36-38.

[18] 郭義東，雨 田，劉超蘭.抗真菌抗生素CA1189產(chǎn)生菌SIIA-A1626的鑒定[J].中國(guó)抗生素雜志，2016，41（8）：590-593，605.

[19] 王繼華，李 晶，楊茹冰，等.一株拮抗鏈格孢（Alternaria spp.）抗生素產(chǎn)生菌研究[J].哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，38（9）：1594-1596，1604.

[20] 李顯志.銅綠假單胞菌多重藥物耐藥性外排泵十年研究回顧（英文）[J].中國(guó)抗生素雜志，2012，37（7）：481-500.

[21] CHANG H H，COHEN T，GRAD Y H，et al. Origin and proliferation of multiple-drug resistance in bacterial pathogens[J].Microbiol Mol Biol Rev，2015，79（1）：101-116.

[22] MEDINA E，PIEPER D H. Tackling threats and future problems of multidrug-resistant bacteria[J].Curr Top Microbiol Immunol，2016，398：3-33.

[23] 劉 萍，閆雪苗，張堅(jiān)磊，等.23株耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌耐藥基因分析[J].山東醫(yī)藥，2016，56（24）：91-93.