劉平賢，張浩，李偉漢

（河南省南陽市中心醫(yī)院，河南 南陽 473009）

據有關數據顯示，每年約120萬女性確診為乳腺癌，死亡人數約45萬，乳腺癌已成為威脅全球女性健康最常見的惡性腫瘤之一[1]。目前，手術切除仍然是治療乳腺癌的主要手段，基于組織病理學診斷結果不僅有助于了解患者的病理特征，而且有利于對患者預后進行準確判斷。但是臨床資料顯示，相同病理結果患者其治療及預后差異較大。有文獻報道稱，由于乳腺癌的高度異質性，即使存在完全相同的組織形態(tài)學結構，其分子遺傳內容的改變也未必相同，這可能是患者治療效果差異的原因之一[2]。探討與浸潤、轉移及無限增殖有關的蛋白分子改變具有重要意義。研究發(fā)現，Snail可調節(jié)腫瘤細胞上皮間質化，促進細胞轉移[3]。B淋巴細胞白血病-2（B-cell lymphorma-2,Bcl-2）基因是腫瘤細胞重要的抗凋亡基因[4]。但是目前關于Snail與Bcl-2是否存在一定關系的報道較少。因此，本研究通過分析2010～2015年在河南省南陽市中心醫(yī)院治療并有完整隨訪記錄的患者的病理特征及預后，結合Snail和Bcl-2蛋白表達水平，為進一步了解乳腺癌的發(fā)病機制，探索新的治療方法提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年4月-2015年5月于本院實施手術切除的92例乳腺癌患者作為研究對象，獲取乳腺癌石蠟組織標本92例，癌旁組織標本92例，癌旁組織距手術邊緣＞3 cm。根據TNM分期標準，Ⅰ、Ⅱ期57例，Ⅲ期35例。根據腫瘤組織分化情況，中、高分化50例，低分化42例。納入標準：①病理結果顯示浸潤性導管癌；②術前未放化療；③近3個月內未服用激素類藥物；④完整的病例資料及隨訪記錄。排除標準：①合并有其他腫瘤；②生存期＜3個月；③存在糖尿病等慢性消耗性疾病?；颊叩牟±碣Y料中，如乳腺癌組織類型雌激素受體（estrogen receptor, ER）、孕激素受體（progesterone receptor, PR）、ki-67及人類表皮生長因子受體2（human epidermalgrowth factor receptor-2,Her-2）免疫組織化學結果均由本院高年資病理醫(yī)師給出。本研究經本院倫理委員會批準，患者均知情并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑及儀器

兔抗人Snail單抗、兔抗人Bcl-2單抗及羊抗兔多抗（英國Abcam公司），二氨基聯苯胺（Diaminobenzidine,DAB）顯色試劑盒（福州邁新生物技術開發(fā)有限公司），免疫組織化學試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司），Ti型熒光顯微鏡（上海尼康儀器有限公司），TC-150型自動脫水機、TB-718型自動包埋機及TK-218V恒溫攤片機型（孝感市湖北泰維醫(yī)療科技有限公司）。

1.3 免疫組織化學法

病理組織經10%甲醛固定、脫水、透明及透蠟后進行石蠟包埋、切片，厚5～6μm，依次進行脫蠟、復水、抗原修復、滅活過氧化氫酶及封閉步驟后，分別加入Snail單抗（1∶30稀釋）或Bcl-2單抗（1∶50稀釋），37℃孵育1 h，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌后加入羊抗兔多抗（1∶1 000稀釋），37℃孵育1 h，PBS洗滌后加入辣根過氧化物，37℃孵育10～20 min，PBS洗滌后加入DAB顯色液，自來水沖洗并進行蘇木精復染，二甲苯透明，中性樹膠封片觀察。以PBS為抗體陰性對照。

1.4 免疫結果判斷

由于Snail和Bcl-2均表達于細胞質中，免疫組織化學法結果可顯示棕黃色或棕褐色。結果由2位未直接參與本研究的病理醫(yī)生在雙盲情況下閱片，根據陽性細胞數目和染色程度進行評分：①陽性細胞數≤5%計0分，＞5%～25%計1分，＞25%～50%計2分，＞50%～75%計3分，＞75%～100%計4分；②染色程度:未見陽性細胞計0分，黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。最終得分=陽性細胞數目得分×染色程度得分，得分＜5分為低表達，≥5分為高表達?；颊逽nail高表達60例，低表達32例；Bcl-2高表達39例，低表達53例。

1.5 統計學方法

數據分析采用SPSS 21.0統計學分析，計數資料以率（%）或構成比表示，比較用χ2檢驗，生存曲線分析采用Kaplan-Meier法中的Log-rank χ2檢驗，相關性分析采用Pearson法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌及癌旁組織中Snail與Bcl-2蛋白表達水平

乳癌癌組織中Snail高表達率為62.5%（60/92），Bcl-2低表達率為57.6%（53/92），癌旁組織中Snail高表達率為39.1%（36/92），Bcl-2低表達率為34.8%（32/92），兩者的Snail和Bcl-2表達率比較，差異有統計學意義（χ2=12.554和9.643，P=0.014和0.046），乳腺癌組織中Snail與Bcl-2表達水平呈負相關（r=-0.519，P=0.021）。見圖 1。

圖1 乳腺癌及癌旁組織中Snail與Bcl-2的表達情況

2.2 Snail表達水平與臨床病理特征的相關性

Snail表達水平與病理分期、腫瘤大小及HER-2無相關性（P＞0.05），與組織學分級、淋巴結是否轉移、雌激素受體（estrogen receptor, ER）及孕激素受體（progesterone receptor, PR）表達有相關性（P＜0.05）。見表1。

表1 Snail表達水平與臨床病理特征的相關性

2.3 Bcl-2表達水平與臨床病理特征的相關性

Bcl-2表達水平與病理分期、組織學分級、淋巴結轉移及HER-2表達無相關性（P＞0.05），與腫瘤大小、ER及PR有相關性（P＜0.05）。見表2。

表2 Bcl-2表達水平與臨床病理特征的相關性

2.4 Snail對乳腺癌患者預后的影響

低表達Snail乳腺癌患者中，骨轉移2例，肝轉移2例，無瘤生存率為87.5%（28/32）；高表達Snail乳腺癌患者中，骨轉移3例，肺轉移2例，腦轉移2例及肝轉移6例，無瘤生存率為78.3%（47/60），兩者無瘤生存率比較，差異有統計學意義（χ2=4.553，P=0.042）。低表達Snail患者死亡1例，高表達Snail患者死亡5例，兩者生存率比較，差異有統計學意義（χ2=5.642，P=0.036）。見圖2。

圖2 高、低表達Snail患者的生存曲線

2.5 Bcl-2對乳腺癌患者預后的影響

高表達Bcl-2乳腺癌患者中，骨轉移2例，肝轉移3例，無瘤生存率為87.2%（34/39）；低表達Bcl-2乳腺癌患者中，骨轉移3例，肺轉移2例，腦轉移2例，肝轉移5例，無瘤生存率為77.4%（41/53），兩者無瘤生存率比較，差異有統計學意義（χ2=6.542，P=0.032）。低表達Bcl-2患者死亡5例，高表達Bcl-2患者死亡1例，兩者生存率比較，差異有統計學意義（χ2=7.215，P=0.028）。見圖3。

圖3 高、低表達Bcl-2患者的生存曲線

3 討論

臨床數據顯示，目前我國乳腺癌發(fā)病率已位居女性癌癥第1位，其發(fā)病率約為萬分之四，且每年以3%的速度逐年增加，并呈現年輕化趨勢[5]。而隨著對乳腺癌發(fā)病機制的深入了解以及分子診斷學技術的發(fā)展，已證實乳腺癌術后復發(fā)與轉移可受到腫瘤微環(huán)境、機體免疫功能及遺傳等多因素調節(jié)，并涉及多基因及多條信號通路。其中Snail與Bcl-2是目前研究乳腺癌轉移及復發(fā)的重要調控因子。由于Snail可通過上調波形蛋白、成纖維細胞特異蛋白和Rho蛋白表達或下調鈣粘附蛋白E表達等途徑導致腫瘤上皮間質化并促進腫瘤轉移的發(fā)生，因而Snail高表達往往意味著腫瘤轉移風險較大，且患者預后不良[6]。Bcl-2蛋白則與Bax蛋白同時表達于正常的乳腺上皮細胞，且兩者表達水平處于動態(tài)平衡中，但乳腺癌組織中多呈現Bcl-2過表達[7]。由此筆者推測Bcl-2/Bax失衡或將導致機體無法及時清除變異的異常細胞，從而為腫瘤的形成或復發(fā)提供條件。而采用藥物抑制Bcl-2蛋白活性，誘導腫瘤凋亡并最終起到殺死腫瘤細胞便是根據Bcl-2的作用機制。

由于腫瘤增殖及轉移在一定程度上或許存在某種聯系，而以往研究中又多將Snail與Bcl-2作為研究腫瘤轉移的重要調控基因或關鍵的藥物靶點，較少涉及到兩者相關性或兩者與腫瘤病理特征及預后關系。但深入了解以上問題，不僅有利于對藥物治療效果的正確評價，還有助于提前制定合理的治療手段，從而提高乳腺癌治療效果及生存率。因此，本研究首先針對乳腺癌組織及癌旁組織中Snail及Bcl-2的表達水平差異進行分析。其結果顯示，Snail及Bcl-2在不同組織中的表達水平有差異，且Snail與Bcl-2表達水平在乳腺癌組織中呈現負相關性。研究顯示，鈣黏附蛋白E是腫瘤上皮間質化的直接調控蛋白，而低分化、高惡性程度的腫瘤組織中往往低表達鈣黏附蛋白E，且Snail又可負性調節(jié)鈣黏附蛋白E，因而，高表達Snail的腫瘤組織或許易發(fā)生腫瘤上皮間質化及腫瘤轉移[8]。但是，作為抗凋亡基因Bcl-2，雖然其在乳腺癌組織及癌旁組織中表達存在差異，但Bcl-2在乳腺癌組織并非高表達，而SMERAGE等也證實，高表達Bcl-2與患者預后具有正相關性[9]。其可能原因是Bcl-2不僅抑制細胞凋亡，也延緩了細胞周期及分裂次數，從而對細胞增殖產生負性作用[10]。而這或許解釋了Snail與Bcl-2存在負相關性的可能性之一，即細胞增殖或許有利于細胞上皮間質化的發(fā)生[11]。

隨后，本研究按臨床病理特征對乳腺癌患者分組，并探討不同情況分組下Snail與Bcl-2的表達情況。其結果顯示，Snail與組織學分級、淋巴結轉移與否以及ER、PR表達存在相關性。由于Snail與腫瘤細胞侵襲能力存在正相關性，而病理分期則是以癌組織浸潤程度為判斷依據之一，而癌組織浸潤程度越高，其發(fā)生癌細胞轉移的幾率也大大增加，因而也更易出現淋巴結轉移。此外，三陰性乳腺癌（ER-/PR-/HER-2-）具有侵襲性強、癌細胞易轉移及預后較差等特點，而從本研究結果可知，Snail與ER及PR均存在負相關性，但Snail與HER-2無明顯相關性，基本與以往報道相符合[12]。其可能存在機制為內分泌激素影響腫瘤微環(huán)境，從而對Snail調節(jié)鈣黏附蛋白E通路產生影響[13]。此外，Bcl-2與腫瘤大小、ER及PR存在相關性。由于腫瘤變大多伴隨腫瘤細胞大量增殖，而此類癌細胞多低表達或不表達Bax，而高表達Bcl-2[14]。MARTIN等[15]研究發(fā)現Bcl-2高表達患者多為ER+或/和PR+，但其具體作用機理仍有待進一步分析。另外，高表達Snail或低表達Bcl-2患者的無瘤生存期及生存率均低于低表達Sanil或高表達Bcl-2患者。結合其病理特征分析，筆者猜測如下原因：①Snail低表達及Bcl-2高表達多為雌/孕激素受體陽性患者，而這類患者進行內分泌治療效果較好；②病理早期、未發(fā)生淋巴轉移或腫瘤較小患者采取手術治療效果較好。

綜上所述，Snail及Bcl-2不僅存在一定負相關性，且在一定程度上均可反應患者病理特征及其預后，不僅可作為治療乳腺癌的藥物靶點，也可作為乳腺癌的診斷指標之一。但鑒于本研究納入樣本數較少，后續(xù)還需進行多樣本，隨機雙盲實驗，以便獲得更加可信的結論。