谷立慧，周文淵，王麗，閆鶴

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642）（2.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）廣泛分布于自然界，也存在于人和動(dòng)物的體表、鼻腔和消化道等部位，是一類共生的人畜共患條件致病菌，能夠引起人和動(dòng)物局部化膿性感染、肺炎、心包炎和膿包敗血癥等，是全球公認(rèn)的醫(yī)院感染病原菌的代表菌株[1,2]。在我國(guó)，20～25%的細(xì)菌性食物中毒事件是由金黃色葡萄球菌引起的，是僅次于沙門(mén)氏菌和副溶血弧菌的第三大致病菌[3,4]。在獸醫(yī)臨床上可廣泛引起疾病，降低動(dòng)物生產(chǎn)力，危害家畜健康。由于畜牧業(yè)發(fā)展的集約化和規(guī)?；?，抗生素在我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)中被大量使用，以促進(jìn)生長(zhǎng)、預(yù)防及治療疾病[5]。金葡菌的適應(yīng)性極強(qiáng)，能夠?qū)π峦度胧褂玫目股匮杆佼a(chǎn)生耐藥性[6]，嚴(yán)重的耐藥問(wèn)題為其防控與治療帶來(lái)了極大挑戰(zhàn)。自2005年首例豬源耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）感染人的病例在荷蘭報(bào)道后[7]，動(dòng)物源金葡菌開(kāi)始備受關(guān)注，它不僅影響畜禽動(dòng)物的安全防治，甚至可能通過(guò)環(huán)境-人、食物鏈-人以及人-人等多種方式進(jìn)行傳播，威脅人類健康。

lsa(E)基因，屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)基因，編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能同時(shí)介導(dǎo)三類不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的抗菌藥物產(chǎn)生耐藥（林克胺類、截短側(cè)耳素類和鏈陽(yáng)菌素A類）[8]，這三類抗菌藥物均為人醫(yī)和獸醫(yī)臨床上非常重要的抗感染藥物。2013年，多重耐藥基因lsa(E)首次在歐洲人源MRSA和MSSA中被檢出[8]，同年，Li等人在豬源MRSA中檢測(cè)到lsa(E)基因，并通過(guò)序列分析證實(shí)該基因位于多重耐藥基因簇中[9]。隨后，該基因在多種細(xì)菌中被發(fā)現(xiàn)，包括：糞腸球菌[10]、屎腸球菌[10]、表皮葡萄球菌[11]、無(wú)乳鏈球菌[12]、豬丹毒桿菌[13]等。動(dòng)物源 lsa(E)基因及其多重耐藥基因簇在不同菌株間進(jìn)行的水平傳播，甚至在動(dòng)物、食品和人之間的交互傳播擴(kuò)散，對(duì)獸醫(yī)臨床和人醫(yī)臨床造成嚴(yán)重威脅。

目前，國(guó)內(nèi)對(duì)于 lsa(E)基因及其耐藥基因簇在動(dòng)物源金黃色葡萄球菌中的流行特點(diǎn)及傳播方式研究少有報(bào)道。因此，本研究以廈門(mén)三大生豬養(yǎng)殖場(chǎng)中分離的金黃色葡萄球菌為研究對(duì)象，檢測(cè) lsa(E)基因及其耐藥基因簇的流行分布情況，分析 lsa(E)基因簇在豬源金葡菌中的傳播方式，調(diào)查 lsa(E)基因陽(yáng)性金葡菌對(duì)臨床抗菌藥物的耐藥性，從而為我國(guó)開(kāi)展動(dòng)物源金葡菌的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估以及降低多重耐藥菌隨食品鏈的傳播提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

2014年從中國(guó)廈門(mén)三個(gè)大型生豬養(yǎng)殖場(chǎng)共采集樣本168份，其中環(huán)境樣本71份，豬鼻拭子97份，樣品于4 ℃保存，并參照國(guó)標(biāo)GB 4789.10-2016的方法進(jìn)行金黃色葡萄球菌的分離鑒定。其中22株金葡菌分離自豬鼻拭子，另外7株菌分離自環(huán)境樣本。

1.2 主要儀器與設(shè)備

GeneAmp PCR system 2700，美國(guó) Applied Biosystems公司；Gel Doc EQ凝膠成像系統(tǒng)、核酸電泳儀，美國(guó)BIO-RAD公司；恒溫培養(yǎng)箱，德國(guó)Binder公司。超凈工作臺(tái)，美國(guó)Baker公司；超純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore公司；高壓滅菌鍋、-80 ℃冰箱，日本三洋公司；電子天平，上海梅特勒托利多儀器有限公司。

1.3 培養(yǎng)基和主要試劑

腦心浸出液肉湯，購(gòu)自廣州環(huán)凱微生物科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒，購(gòu)自北京博邁德生物技術(shù)有限公司；rTaq酶（5 U/μL）、dNTP Mixture、10×PCR Buffer，購(gòu)自日本 TaKaRa公司；5×Loading Buffer、DL2000 DNA marker、瓊脂糖，購(gòu)自艾迪生物科技有限公司；引物，由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成；藥敏紙片，購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

1.4 基因檢測(cè)

根據(jù)細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA的提取。將提取的細(xì)菌總DNA作為模板，采用PCR方法檢測(cè)lsa(E)基因，以NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的豬源MRSA PV7037(JX560992)的lsa(E)基因環(huán)境序列為參考（圖1）。

設(shè)計(jì)引物，對(duì) lsa(E)基因陽(yáng)性菌株，進(jìn)行overlapping PCR，基因引物及退火溫度見(jiàn)下表1。據(jù)此檢測(cè)多重耐藥基因簇的流行情況。PCR總反應(yīng)體系為 25 μL，擴(kuò)增條件：94 ℃，5 min；94 ℃，1 min、退火溫度(表 1)，1 min、72 ℃，2 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃，7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照并分析，將陽(yáng)性產(chǎn)物送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行 NCBI序列比對(duì)分析。

圖1 lsa(E)的基因環(huán)境Fig.1 Genetic environment of the lsa(E) gene

1.5 抗菌藥物敏感試驗(yàn)

采用CLSI推薦的紙片擴(kuò)散法（Kirby-Bauer，K-B）進(jìn)行抗生素藥物敏感性試驗(yàn)，結(jié)果按照CLSI（2012）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判斷。測(cè)試的抗生素有：青霉素、苯唑西林、頭孢西丁、頭孢噻吩、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、加替沙星、喹奴普汀/達(dá)福普汀、利奈唑胺、復(fù)方新諾明、克拉霉素、克林霉素、慶大霉素。質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC29213，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

表1 lsa(E)基因和overlapping PCR引物Table 1 The Primers for lsa(E) gene and overlapping PCR

2 結(jié)果與討論

2.1 lsa(E)基因檢測(cè)

2013年，Sarah等[8]人首次在人源MRSA和MSSA中發(fā)現(xiàn)并定義lsa(E)基因，同年，Li等人在江蘇及浙江豬場(chǎng)中分離得到的豬源 MRSA中檢測(cè)到 lsa(E)基因，檢出率為22.9%(16/70)[9]。2014年Yan等[14]對(duì)中國(guó)哈爾濱兩個(gè)屠宰場(chǎng)的豬源金葡菌進(jìn)行 lsa(E)基因篩查，檢測(cè)率為22.0%(44/200)。

在本研究中，對(duì)于廈門(mén)豬場(chǎng)分離得到的金葡菌中l(wèi)sa(E)基因的檢出率為 100.0%(29/29)，表明近兩年lsa(E)基因在我國(guó)豬源金葡中廣泛傳播，該結(jié)果與李君[15]對(duì)上海、寧夏、河南及山東的豬源MRSA的lsa(E)基因的檢出率相同。lsa(E)基因在越來(lái)越多細(xì)菌中的發(fā)現(xiàn)及檢出率的顯著提高表明可能存在可移動(dòng)原件促使該基因廣泛傳播，從而給臨床抗感染治療帶來(lái)更大困難，應(yīng)該引起高度重視。

2.2 lsa(E)多重耐藥基因簇

深入研究發(fā)現(xiàn)，lsa(E)基因主要存在于多重耐藥基因簇中：aadE-spc-lsa(E)-lnu(B)-tnp，該基因簇通常含有多個(gè)耐藥基因，分別為介導(dǎo)氨基糖苷類抗生素耐藥的基因aadE和spc，林可酰胺-截短側(cè)耳素-鏈陽(yáng)菌素A類的耐藥基因 lsa(E)，介導(dǎo)林可酰胺類耐藥的基因lnu(B)以及轉(zhuǎn)座酶tnp[10,11,15]。運(yùn)用overlapping PCR的方法對(duì) lsa(E)陽(yáng)性菌株進(jìn)行基因簇篩查，結(jié)果顯示，96.6% (28/29)的菌株均含有多重耐藥基因簇中的aadE-spc-lsa(E)-lnu(B)-tnp區(qū)域，僅有一株菌含有l(wèi)sa(E)基因，但不含該基因簇，4個(gè)overlapping PCR反應(yīng)均為陰性，該菌株分離自養(yǎng)殖場(chǎng)的地面環(huán)境中，耐藥譜為PEN-TET-SXT-CLI-CIP-LEV-MXF，且對(duì)慶大霉素和左氧氟沙星中介耐藥，而對(duì)苯唑西林、頭孢噻吩、頭孢西丁、克拉霉素、喹奴普汀-達(dá)福普汀和利奈唑胺敏感。

aadE-spc-lsa(E)-lnu(B)-tnp基因簇較為保守，在目前已經(jīng)報(bào)道的研究中，除豬丹毒桿菌外，該基因簇在其他多種病原菌中穩(wěn)定存在[10～12,15]，可能是由于該序列中不含插入序列，因此不易發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，同時(shí)該基因簇可能通過(guò)質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)種內(nèi)及種間交換，從而加劇不同種屬間耐藥基因的相互傳播。而使用該基因簇介導(dǎo)的氨基糖苷類、林可酰胺、截短側(cè)耳素、鏈陽(yáng)菌素A類抗生素中的任意一種均可對(duì)該基因簇產(chǎn)生選擇性壓力，促進(jìn)其傳播擴(kuò)散，因此，需加強(qiáng)對(duì)含有多重耐藥基因簇菌株的監(jiān)控。

2.3 lsa(E)基因陽(yáng)性菌株對(duì)抗生素的耐藥情況

對(duì)分離出的29株lsa(E)基因陽(yáng)性的金葡菌進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，耐藥情況見(jiàn)表 2。大環(huán)內(nèi)酯類、林可胺類和磺胺類抗生素是養(yǎng)殖場(chǎng)常用抗生素，也是臨床常用的抗葡萄球菌感染藥物，本研究中，29株lsa(E)基因陽(yáng)性金葡菌對(duì)克拉霉素、克林霉素和復(fù)方新諾明的耐藥率分別為93.1%、100.0%和100.0%。其次，對(duì)慶大霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星及莫西沙星的耐藥率均大于70%，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有對(duì)苯唑西林、喹奴普汀/達(dá)福普汀和利奈唑胺耐藥的金葡菌。

Cui等[16]人對(duì)陜西、河北、四川、湖北地區(qū)分離的豬源MRSA進(jìn)行了抗生素敏感性檢測(cè)，結(jié)果顯示，分離獲得的菌株對(duì)環(huán)丙沙星、克林霉素、頭孢西丁、慶大霉素及四環(huán)素普遍耐藥，未發(fā)現(xiàn)有對(duì)利奈唑胺耐藥的菌株。

李君等[15]人研究表明上海、寧夏、河南及山東的豬源lsa(E)基因陽(yáng)性MRSA主要對(duì)四環(huán)素(99.6%)、紅霉素(97.0%)、喹奴普汀/達(dá)福普汀(97.0%)以及慶大霉素(80.4%)呈現(xiàn)出較高耐藥，普遍的高耐藥應(yīng)引起我們不斷重視。而且，越來(lái)越多的研究表明，豬和豬肉可以作為細(xì)菌轉(zhuǎn)移的重要載體，通過(guò)食物鏈將養(yǎng)殖場(chǎng)的細(xì)菌以及其攜帶的耐藥性向下游的屠宰場(chǎng)、市場(chǎng)傳播[17,18]，進(jìn)而對(duì)食品安全和人類健康帶來(lái)了一定嚴(yán)重的威脅。

表2 金黃色葡萄球菌對(duì)抗生素的藥敏結(jié)果Table 2 Drug susceptibility testing of S. aureus isolates

2.4 lsa(E)基因陽(yáng)性菌株的多重耐藥分析

金葡菌對(duì)九大類抗生素的多重耐藥情況見(jiàn)表 3。定義菌株對(duì)三大類及以上抗生素耐藥的菌為多重的耐藥菌。

表3 金黃色葡萄球菌多重耐藥分析Table 3 Multidrug drug resistance analysis for S. aureus isolates

結(jié)果表明，養(yǎng)殖場(chǎng)中29株菌均為多重的耐藥菌，而且耐七大類抗生素的菌株有22株，占比75.9%，耐藥譜主要為PEN-GEN-TET-CLA-SXT-CLI-CIP-MXF。

多重耐藥率達(dá)到100.0%，與樊潤(rùn)等[19]人對(duì)河南省豬源MRSA分離株的多重耐藥率相同。另一項(xiàng)研究[20]表明我國(guó)河北、陜西、湖北和四川的生豬養(yǎng)殖場(chǎng)或屠宰場(chǎng)金葡菌的主要耐藥表型為 CIP-CLI-ERY-FOXGEN-TET-CHL和 CIP-CLI-ERY-FOX-GEN-TET。金葡菌的流行擴(kuò)散對(duì)食品安全和人們健康有著不可估量的潛在威脅，而多重耐藥是一個(gè)長(zhǎng)期存在的問(wèn)題，藥物壓力造成細(xì)菌的選擇性耐藥，因此，應(yīng)不斷加大對(duì)動(dòng)物源食品耐藥菌的監(jiān)控，尤其是加強(qiáng)對(duì)多重耐藥基因和基因簇的監(jiān)控，降低食物鏈轉(zhuǎn)移多重耐藥基因的風(fēng)險(xiǎn)。

3 結(jié)論

3.1 本研究分離的豬源金葡菌中，均含有能介導(dǎo)細(xì)菌對(duì)林可胺類、截短側(cè)耳素及鏈陽(yáng)菌素A類耐藥的lsa(E)基因，運(yùn)用overlapping PCR擴(kuò)增其多重耐藥基因簇：aadE-spc-lsa(E)-lnu(B)-tnp，陽(yáng)性率為96.6%，僅有一株菌含有 lsa(E)基因，但不含該基因簇。該多重耐藥基因簇較為保守，不易發(fā)生結(jié)構(gòu)的變化，這是加劇不同種屬間耐藥基因相互傳播的重要原因。

3.2 29株lsa(E)基因陽(yáng)性的金葡菌對(duì)15種藥物表現(xiàn)出不同的耐藥性。對(duì)常用抗生素克拉霉素、克林霉素、復(fù)方新諾明、慶大霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星及莫西沙星的耐藥率均大于70%，耐藥情況嚴(yán)峻，沒(méi)有對(duì)苯唑西林、喹奴普汀/達(dá)福普汀和利奈唑胺耐藥的金葡菌，說(shuō)明藥物壓力造成了細(xì)菌的選擇性耐藥。

3.3 29株菌均為多重耐藥菌，多重耐藥率達(dá)到100.0%，耐七大類抗生素的菌株占比75.9%，耐藥譜主要為PEN-GEN-TET-CLA-SXT-CLI-CIP-MXF，這對(duì)動(dòng)物和人類臨床治療在抗生素的選擇上有一定的指導(dǎo)作用。