歐陽(yáng)道福，楊澤銳，郁曉藝，吳曉春

（完美（廣東）日用品有限公司，完美（中國(guó)）有限公司，廣東中山 528402）

肽藻營(yíng)養(yǎng)粉由南瓜粉、大豆肽、薏苡仁粉、低聚果糖、乳清蛋白、螺旋藻、玉米粉、植脂末、麥芽、蓮子粉、乙基麥芽酚、三氯蔗糖為原料，經(jīng)混合、分裝制成的具有增強(qiáng)免疫力功能的保健食品，其含有豐富的多肽類(lèi)及游離氨基酸類(lèi)成分。氨基酸是構(gòu)成人體蛋白質(zhì)的組成部分，也是機(jī)體合成抗體、激素、酶類(lèi)以及其他組織的原料。而且作為一種人體可直接吸收的營(yíng)養(yǎng)成分，它的含量和成分能夠部分地反映出食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，游離氨基酸不僅可以維護(hù)新陳代謝、生長(zhǎng)、免疫，還可以呈現(xiàn)出酸、甜、苦、澀及鮮等味道，賦予了食品豐富的味覺(jué)層次[1]。然而對(duì)于肽藻營(yíng)養(yǎng)粉中游離氨基酸的種類(lèi)及其含量的研究目前并未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

目前文獻(xiàn)資料及國(guó)標(biāo)中主要采用氨基酸分析儀法和高效液相色譜法[2～6]測(cè)定氨基酸的含量。氨基酸分析儀法具有操作簡(jiǎn)便，無(wú)需單獨(dú)進(jìn)行柱前衍生等優(yōu)點(diǎn)，但在運(yùn)用過(guò)程中-有硬件配置復(fù)雜、用途專(zhuān)一、靈活性差、購(gòu)買(mǎi)及維護(hù)成本高、分析時(shí)間很長(zhǎng)、破壞氨基酸的固有結(jié)構(gòu)等缺點(diǎn)；近年來(lái)高效液相色譜已廣泛用于氨基酸的測(cè)定，其無(wú)需特殊反應(yīng)裝置，具有高效、簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確和價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，已成為檢測(cè)氨基酸的首選方法。

本研究參考GB/T 22729-2008海洋魚(yú)低聚肽粉[7]中游離氨基酸高效液相色譜儀測(cè)定法建立了柱前自動(dòng)衍生化 RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定肽藻營(yíng)養(yǎng)粉多種游離氨基酸的方法，以期為肽藻營(yíng)養(yǎng)粉及其同類(lèi)產(chǎn)品中游離氨基酸種類(lèi)的確定及其質(zhì)量控制提供參考，同時(shí)確定肽藻營(yíng)養(yǎng)粉中游離氨基酸的種類(lèi)及其具體含量，為其增強(qiáng)免疫力保健功能的物質(zhì)基礎(chǔ)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

游離氨基酸混合對(duì)照品（1 nmol/μL），（批號(hào)：BCBT8196）：美國(guó)安捷倫科技有限公司；完美餐牌肽藻營(yíng)養(yǎng)粉（批號(hào)為 164227-1、164227-2、164227-3、164227-4、164227-5、164227-6）：完美（中國(guó)）有限公司；純化水、超純水：超純水系統(tǒng)制備；三氯乙酸、冰醋酸、三水合乙酸鈉、三乙胺、3-巰基丙酸、硼酸、四氫呋喃：分析純，廣州化學(xué)試劑廠；甲醇、乙腈：色譜純，美國(guó)默克公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Sartorius CPA225D電子天平：德國(guó)賽多利思公司；Agilent 1260高效液相色譜儀：美國(guó)安捷倫公司；Elma P180H型超聲波清洗器：德國(guó)艾爾瑪公司；AnkeLXJ-IIB離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；MILLI-Q超純水系統(tǒng)：德國(guó)默克公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱為Agilent Hypersil ODS；柱溫40 ℃；檢測(cè)器為二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為 0～24 min為338 nm，24 min以后切換為262 nm；流動(dòng)相A：醋酸鈉-三乙胺緩沖液（pH 7.20±0.05），加入0.5%四氫呋喃調(diào)節(jié)峰型；流動(dòng)相B：醋酸鈉緩沖液（pH 7.20±0.05）-乙腈-甲醇（20∶40∶40），梯度洗脫，洗脫程序?yàn)?0～27 min，92%～40% A；27～31.5 min，40%～0% A；31.5～32 min，0% A；32～34 min，0%～100% A；34～35.5 min，100%～92% A；流速為1.0 mL/min。

1.3.2 溶液的配制

1.3.2.1 硼酸緩沖液的配制

稱(chēng)取2.44 g硼酸至100 mL燒杯中，加水溶解，加200 g/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至10.2±0.1，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.3.2.2 OPA衍生劑的配制

稱(chēng)取100 mg OPA到10 mL容量瓶中，加1 mL乙腈，130 μL 3-巰基丙酸，以0.4 mol/L硼酸緩沖液定容至刻度，搖勻。

1.3.2.3 FOMC-Cl衍生劑的配制

稱(chēng)取50 mg FOMC-Cl到10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，搖勻。

1.3.2.4 對(duì)照品溶液的配制

取游離氨基酸混合對(duì)照品（1 nmol/μL）直接過(guò)0.45 μm水相濾膜，即得。1.3.2.5 供試品溶液的制備

精密稱(chēng)取肽藻營(yíng)養(yǎng)粉樣品1 g于25 mL容量瓶中，加入20 mL 5%三氯乙酸溶液，超聲20 min，定容至25 mL，靜置2 h，4000 r/min離心30 min，取上清液過(guò)0.45 μm水相濾膜，即為供試品溶液。

1.3.3 衍生方法

利用自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)行在線自動(dòng)衍生：衍生程序如表1所示：

表1 柱前衍生化步驟Table 1 The steps of precolumn derivatization

注：樣品瓶1放置OPA衍生劑；樣品瓶2放置FOMC-Cl衍生劑；樣品瓶3放置水（瓶蓋不加墊片）；樣品瓶4放置0.4 mol/L硼酸。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的優(yōu)化

2.1.1 流動(dòng)相的選擇

比較了以下兩種流動(dòng)相：流動(dòng)相1：流動(dòng)相A：醋酸鈉-三乙胺緩沖液（pH 7.20±0.05），加入0.3%四氫呋喃調(diào)節(jié)峰型；流動(dòng)相 B：醋酸鈉緩沖液（pH 7.20±0.05）-乙腈-甲醇（20∶40∶40）（國(guó)標(biāo) GB/T 22729-2008中使用的流動(dòng)相）；流動(dòng)相2：流動(dòng)相A：醋酸鈉-三乙胺緩沖液（pH 7.20±0.05），加入0.5%四氫呋喃調(diào)節(jié)峰型；流動(dòng)相 B：醋酸鈉緩沖液（pH 7.20±0.05）-乙腈-甲醇（20∶40∶40）。

兩種流動(dòng)相條件均梯度洗脫，洗脫程序?yàn)?0～27 min，92%～40% A；27～31.5 min，40%～0% A；31.5～32 min，0% A；32～34 min，0%～100% A；34～35.5 min，100%～92% A；流速為1.0 mL/min；色譜柱為Agilent Hypersil ODS；柱溫40 ℃；檢測(cè)器為二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為0～24 min為338 nm，24 min以后切換為262 nm。

在此條件下，由圖1可知，兩種流動(dòng)相條件下均能使17種氨基酸進(jìn)行有效分離，但是流動(dòng)相1中峰2的峰型較差，且各成分保留時(shí)間相對(duì)偏后，分析時(shí)間較長(zhǎng)，因此選擇流動(dòng)相2作為最終流動(dòng)相。

圖1 不同流動(dòng)相考察結(jié)果圖Fig.1 HPLC chromatograms with different mobile phase

2.1.2 色譜柱的選擇

圖2 不同色譜柱考察結(jié)果圖Fig.2 HPLC chromatograms with different type of column

本研究系統(tǒng)考察了三種不同型號(hào)（Agilent Hypersil ODS，5 μm，4.0×250 mm；Agilent Extend ODS，5 μm，4.6×250 mm；Waters Symmestry ODS，5 μm，4.6×250 mm）色譜柱的效果，結(jié)果如圖2所示，Symmestry和Extend的柱子分離度和脯氨酸（17號(hào)峰）的峰型均不理想，綜合分析Hypersil柱子的分離度和峰型均達(dá)到最佳狀態(tài)。

2.1.3 柱溫的選擇

圖3 不同柱溫考察結(jié)果圖Fig.3 Figures of HPLC chromatograms with different column temperature

溫度的微小變化能引起流動(dòng)相密度改變，進(jìn)而改變對(duì)分析物的溶解能力，所以調(diào)節(jié)柱溫可以調(diào)節(jié)目標(biāo)化合物的分離效果。本研究考察了三種不同柱溫條件下色譜的分離情況，結(jié)果如圖3所示，35 ℃下13和14號(hào)峰分離度為1.37，45 ℃下3號(hào)峰出現(xiàn)裂峰，峰型不好，綜合分析40 ℃條件下分離度和峰型均達(dá)到最佳狀態(tài)，因此最終選擇柱溫為40 ℃。

2.1.4 衍生方式的選擇

氨基酸極性較強(qiáng)，為提高其在反相液相色譜柱上的保留，常常需要將氨基酸進(jìn)行柱前衍生。柱前自動(dòng)衍生-HPLC法測(cè)定氨基酸的含量時(shí)，由于衍生試劑或衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定，導(dǎo)致手工操作很難保證衍生過(guò)程的快速、及時(shí)、均一。本方法采用帶全自動(dòng)衍生功能的自動(dòng)進(jìn)樣器按預(yù)先設(shè)定的程序，以O(shè)PA和FOMC-Cl為衍生試劑進(jìn)行在線衍生，衍生后直接進(jìn)樣分析，有效消除了離線衍生由于進(jìn)樣時(shí)間不同和手工操作速度慢、不均一造成的誤差，不僅提高了準(zhǔn)確性，而且簡(jiǎn)化了操作過(guò)程并降低了工作強(qiáng)度[8～10]。

2.1.5 色譜條件確認(rèn)

根據(jù)“2.1.1～2.1.4”考察所得結(jié)果，精密吸取混合對(duì)照品溶液、空白溶劑試液以及供試品試液各1 μL，按照“1.3.3”項(xiàng)在線衍生處理后，以“1.3.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖 4。結(jié)果表明，在此色譜條件下，各氨基酸成分可以有效分離，空白溶劑在與混合對(duì)照品溶液色譜圖相同保留時(shí)間處不出現(xiàn)相同色譜峰，而供試品在與混合對(duì)照品溶液色譜圖相同保留時(shí)間處出現(xiàn)相同色譜峰。說(shuō)明該方法專(zhuān)屬性性好，陰性無(wú)干擾。氨基酸 17個(gè)衍生物色譜峰的分離度及理論塔板數(shù)見(jiàn)表2。由表2可知，各氨基酸衍生物的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均大于10000。（注：在空白溶劑色譜圖上，與5號(hào)對(duì)照品相同位置處出現(xiàn)一個(gè)色譜峰，但其信噪比僅為6.1，低于定量限，故可忽略不計(jì)）。

圖4 各溶液高效液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of different solutions

2.2 線性關(guān)系與定量限考察

分別將“1.3.2.4”項(xiàng)下的混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為0.025、0.063、0.125、0.200、0.500、1.000 nmol/μL，在線衍生之后進(jìn)行色譜分析，以各氨基酸的峰面積為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的氨基酸含量為橫坐標(biāo)繪制工作曲線，并求出回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)以及線性范圍，并以信噪比 S/N=10時(shí)的質(zhì)量濃度作為定量限，測(cè)得各氨基酸的定量限。結(jié)果見(jiàn)表 3。結(jié)果表明，在下述濃度范圍內(nèi)，各氨基酸與各自峰面積呈良好的線性關(guān)系。

表2 氨基酸對(duì)照品各衍生物分離度及理論塔板數(shù)Table 2 Resolution and theoretical plate number for peaks of reference substances derivatives

表3 線性關(guān)系及定量限考察結(jié)果Table 3 The result of linearity and the limit of quantitation

2.3 精密度、重復(fù)性以及加樣回收率實(shí)驗(yàn)

表4 精密度、重復(fù)性以加樣回收率考察結(jié)果Table 4 The result of precision epeatability and recovery(n=6)

取“1.3.2.4”項(xiàng)下的混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品，在線衍生之后進(jìn)行色譜分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定17種氨基酸衍生物進(jìn)樣精密度；精密稱(chēng)取樣品（164227-1）6份，每份約1 g，按照“1.3.2.5”項(xiàng)下制備供試品溶液，在線衍生之后進(jìn)行色譜分析，計(jì)算各種氨基酸含量及RSD，作為重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果；精密稱(chēng)取已知含量的樣品（164227-1）6份，精密加入“1.3.2.4”項(xiàng)下的混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品各1 mL，按照“1.3.2.5”項(xiàng)下制備供試品溶液，在線衍生之后進(jìn)行色譜分析，計(jì)算回收率和RSD。結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明，17種氨基酸的精密度均小于2%，說(shuō)明儀器精密度良好；重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中，除了異亮氨酸外（RSD值為10.20%），其余各種氨基酸的RSD均小于10%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性好；各氨基酸回收率在 85%～115%之間（除胱氨酸略高外），RSD基本均小于5%。

2.4 樣品含量測(cè)定

取6個(gè)批次肽藻營(yíng)養(yǎng)粉樣品各1 g，按“1.3.2（5）”項(xiàng)下的方法操作制備供試品溶液，每個(gè)樣品平行2份，按照“1.3.3”項(xiàng)在線衍生處理后，以“1.3.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析，計(jì)算各供試品中17個(gè)游離氨基酸的含量以及總量，由測(cè)定結(jié)果（表 5）可知，樣品中至少含有14種氨基酸，其中6種為人體必需氨基酸。氨基酸總量均在500 mg/100 g以上，亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、精氨酸、天門(mén)冬氨酸、谷氨酸的含量均達(dá)到 50 mg/100 g以上，可見(jiàn)該營(yíng)養(yǎng)粉中的氨基酸資源非常豐富，為其增強(qiáng)免疫力保健功能的物質(zhì)基礎(chǔ)提供了數(shù)據(jù) 支撐。

表5 6批次肽藻營(yíng)養(yǎng)粉中17種游離氨基酸含量Table 5 Contents of 17 kings of free amino acids in peptide nutrition powder (n=2)

3 結(jié)論

本研究通過(guò)綜合考察建立了一種利用高效液相色譜測(cè)定肽藻營(yíng)養(yǎng)粉中游離氨基酸含量的方法，同時(shí)也確認(rèn)了肽藻營(yíng)養(yǎng)粉中的游離氨基酸種類(lèi)及其含量，該方法專(zhuān)屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好，適用于肽藻營(yíng)養(yǎng)粉中游離氨基酸的質(zhì)量控制，對(duì)于其他同類(lèi)型產(chǎn)品也有一定借鑒參考意義。