周鳳竹，胡亞文，葛文雪，張雪蓮

復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳工程國家重點實驗室， 上海 200433

異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase，ICD)是三羧酸(tricarboxylic acid cycle，TAC)循環(huán)中的關(guān)鍵酶，在輔酶存在時調(diào)節(jié)D-異檸檬酸氧化脫羧生成α-酮戊二酸和二氧化碳。該限速步驟是TCA循環(huán)中第1個生成NADPH的反應(yīng)。結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株編碼兩種ICD，分別為ICD1和ICD2[1]。牛分枝桿菌卡介苗(bacillus Calmette-Guérin，BCG)菌株編碼與H37Rv完全同源的ICD1和ICD2。利用工程菌表達(dá)的重組ICD1和ICD2在體外均有生物學(xué)功能[3]，但它們對輔酶NADP的親和力不同，Km(NADP)值及pH耐受性和熱穩(wěn)定性也有所不同[2]。在BCG菌體中敲除icd2無法檢出ICD酶活，同時敲除株產(chǎn)生表型缺陷，需在培養(yǎng)基中添加谷氨酰胺才能正常生長，敲除icd1則對ICD酶活基本無影響，表明ICD2是BCG中負(fù)責(zé)碳通量進(jìn)入TAC的關(guān)鍵酶，但I(xiàn)CD1的生理作用尚不清楚[4]。同時，由于敲除結(jié)核分枝桿菌中icd2的研究均沒有成功，推測icd2可能是結(jié)核分枝桿菌生長的必需基因[5]。與BCG和結(jié)核分枝桿菌不同，恥垢分枝桿菌只編碼1種ICD——MsICD，與結(jié)核分枝桿菌中ICD2高度同源，編碼基因MSMEG_1654為恥垢分枝桿菌生長的必需基因[4]。

恥垢分枝桿菌由于生長較快，又同屬分枝桿菌屬，常被用來研究分枝桿菌的生理及代謝功能。由于分枝桿菌體內(nèi)重組率非常低，其基因敲除一直是個難題。迄今雖然發(fā)展出許多方法來提高結(jié)核分枝桿菌的重組效率，如高滴度噬菌體特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)[6]、溫敏型重組質(zhì)粒介導(dǎo)的同源重組[7]等，但無法實現(xiàn)對必需基因的敲除。成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列干擾(clustered regularly interspaced short palindromic repeat interference，CRISPRi)技術(shù)是一種基于Cas9的調(diào)控基因表達(dá)的技術(shù)，其中Cas9是來自Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)的RNA介導(dǎo)的DNA內(nèi)切核酸酶[8]。當(dāng)這種缺乏核酸內(nèi)切酶活性即無催化功能的Cas9與設(shè)計好的向?qū)NA共表達(dá)時，可產(chǎn)生一種DNA識別復(fù)合物，這種復(fù)合物可特異性干擾RNA聚合酶或轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合，從而阻礙DNA轉(zhuǎn)錄[9-11]。Rock等對這種技術(shù)改進(jìn)，使其能應(yīng)用于分枝桿菌屬的細(xì)菌轉(zhuǎn)錄干擾[12]。本研究以恥垢分枝桿菌中編碼ICD的MSMEG_1654基因為靶基因，利用CRISPRi技術(shù)，成功構(gòu)建MsICD敲低菌株，在無水四環(huán)素(anhydrotetracycline，ATc)誘導(dǎo)下表達(dá)dCas9和單向?qū)NA(single guide RNA，sgRNA)，對其進(jìn)行干擾，在細(xì)菌基因組不發(fā)生變化的情況下MsICD的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平下降，為構(gòu)建必需基因敲除提供了可靠方法，并為后期研究結(jié)核分枝桿菌ICD敲低及分枝桿菌ICD在碳源代謝和碳通量分流調(diào)控機(jī)制中的作用提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1引物表1中的引物全部由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1本研究使用的引物
Tab.1Primersusedinthisstudy

PrimerSe-quencesgRNA-S5′-GG-GAGCGAATTTCCGTACCACCGG-3′sgRNA-A5′-AAAC-CCGGTGGTACGGAAATTCGC-3′ICDq-S5′-GCAGC-CGACCATCATCTACA-3′ICDq-A5′-AC-CGAGATGTCGCTGGTTTT-3′sigA-S5′-CGTC-CGGCGACTTCGTGT-3′sigA-A5′-CCT-TGCCGATCTGCTTGAGGTA-3′

1.1.2其他材料恥垢分枝桿菌mc2155菌株、大腸埃希菌DH5α菌株由本實驗室保存。PLJR962質(zhì)粒由哈佛大學(xué)Sarah M. Fortune課題組惠贈?？菇Y(jié)核分枝桿菌ICD2兔多克隆抗體、抗結(jié)核分枝桿菌DosR兔多克隆抗體由吉爾生化(上海)有限公司定制，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG多克隆抗體購自Proteintech。主要試劑包括BsmBⅠ(NEB)、T4連接酶(NEB)、無水四環(huán)素(TaKaRa)、PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)、2×T5 Fast qPCR Mix(SYBR Green I)(北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司)、Middlebrook 7H9 Broth(Difco)等。其他化學(xué)試劑均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1敲低菌株的構(gòu)建將合成的sgRNA-S和sgRNA-A按1∶1摩爾比加入去離子水中退火，95 ℃ 2 min，自然冷卻至室溫。將PLJR962載體及退火后的sgRNA分別在55 ℃用BsmBⅠ酶切4 h，回收產(chǎn)物后，以T4連接酶室溫連接2 h，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞并涂布于卡那霉素抗性平板，篩選陽性克隆。測序驗證載體構(gòu)建成功后，將陽性質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入恥垢分枝桿菌mc2155感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于卡那霉素抗性平板，篩選陽性克隆菌落。

1.2.2細(xì)菌生長差異挑選陽性克隆菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)。細(xì)菌生長至OD600為 0.6 后，離心收集菌體，并加入培養(yǎng)基重懸菌體。將菌液密度梯度稀釋至10-5，每個梯度取3 μL，分別點板于含有30 μg/mL卡那霉素的7H10-OADC固體板及含30 μg/mL卡那霉素、100 μg/mL無水四環(huán)素的7H10-OADC固體板。取上述重懸后的菌液，加入50 mL 7H9-OADC液體培養(yǎng)基(含30 μg/mL卡那霉素和100 μg/mL無水四環(huán)素)，使初始OD600為 0.02，37 ℃ 100 r/min振蕩培養(yǎng)，于接種后0、4、8、12、24、30、36、48、72 h取樣檢測OD600。每次實驗設(shè)置3個平行重復(fù)。

1.2.3icd轉(zhuǎn)錄水平檢測將陽性菌落轉(zhuǎn)移至液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，至OD600為 0.3，加入100 μg/mL無水四環(huán)素，繼續(xù)37 ℃ 100 r/min培養(yǎng)14 h，室溫 4 000 r/min離心10 min，收集菌體。采用TRIzol法抽提細(xì)菌RNA[13]。去除基因組DNA的反轉(zhuǎn)錄采用PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒，程序為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。取100 ng反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative polymerase chain reaction，qPCR)，程序為95 ℃ 1 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 5 s，72 ℃ 15 s，共40個循環(huán)，72 ℃采集熒光信號。以sigA為內(nèi)標(biāo)，設(shè)置3個平行組，按目標(biāo)基因相對于內(nèi)標(biāo)基因的擴(kuò)增量為2-ΔΔCt處理數(shù)據(jù)，其中-ΔΔCt=-(ΔCt,q-ΔCt,cb)，ΔCt,q為目標(biāo)基因循環(huán)數(shù)，ΔCt,cb為內(nèi)標(biāo)基因循環(huán)數(shù)。

1.2.4ICD蛋白表達(dá)水平檢測將陽性菌落轉(zhuǎn)移至液體培養(yǎng)基(含或不含100 μg/mL無水四環(huán)素)中培養(yǎng)至OD600為0.6，室溫 4 000 r/min離心10 min，收集菌體，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗2次，收集菌體。加入適量1×PBS重懸，以100 W，開2 s，關(guān)2 s，循環(huán)100次，冰水浴超聲破碎細(xì)菌，13 000 r/min離心30 min。取上清液，BCA法測定菌體蛋白濃度。取50 μg全菌蛋白進(jìn)行蛋白免疫印跡檢測，一抗為抗結(jié)核分枝桿菌ICD2兔多克隆抗體，以抗結(jié)核分枝桿菌DosR兔多克隆抗體為對照，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG多克隆抗體。

1.2.5ICD酶活測定ICD酶活測定體系[3]包括20 mmol/L三乙醇胺緩沖液(pH 7.5)、2 mmol/L NADP、10 mmol/L MgCl2、100 mmol/L NaCl、50 μg全菌蛋白，用ddH2O補齊至180 μL，最后加入 3 mmol/L異檸檬酸至終體積為200 μL，立即置入酶標(biāo)儀測定OD340，25 ℃連續(xù)讀數(shù)15 min。根據(jù)Unit=ΔOD340/(ε340·l·Δtm)計算比活力。其中ΔOD340為最大反應(yīng)速度期間OD340值之差，ε340=6.22 mmol/(L.cm)，l=0.45 cm。設(shè)置3個平行組。

2 結(jié)果

2.1 敲低菌株的構(gòu)建

本研究使用的CRISPRi技術(shù)是通過無水四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)PLJR962質(zhì)粒中的dCas9和sgRNA，后兩者同時結(jié)合特異DNA位點，阻止轉(zhuǎn)錄的起始或延伸。dCas9來自嗜熱鏈球菌，可結(jié)合sgRNA，但無催化活性。采用這種CRISPRi技術(shù)時，需設(shè)計用來靶定特異DNA位點的sgRNA。前間區(qū)序列鄰近基序(protospacer adjacent motif，PAM)是一段較短的DNA序列，可促使Cas9-sgRNA復(fù)合體形成R-環(huán)并阻礙轉(zhuǎn)錄。本研究采用的PAM序列為5′-CTTCT-3′，位于靶定基因MSMEG_1654的5′端附近。

將構(gòu)建完成的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入恥垢分枝桿菌后，sgRNA與dCas9結(jié)合，sgRNA識別互補配對的基因組中的堿基序列并結(jié)合。轉(zhuǎn)錄開始后，RNA聚合酶到達(dá)sgRNA結(jié)合位點，由于此處DNA鏈被dCas9和sgRNA結(jié)合無法打開，即無法繼續(xù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，從而達(dá)到降低表達(dá)水平的目的。

2.2 細(xì)菌生長差異

經(jīng)過抗性篩選后，將生長至相同密度的菌液梯度稀釋后點板，在培養(yǎng)基中添加無水四環(huán)素誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄抑制時，ICD-KD菌株的生長速率明顯減緩(圖 1)，在10-2(約2×105個細(xì)胞/mL)已產(chǎn)生肉眼可見的生長差異。隨著點板菌液密度降低，敲低菌株的生長減緩現(xiàn)象愈加明顯。液體培養(yǎng)基中的生長曲線(圖 2)也表明，ICD-KD菌株在添加無水四環(huán)素條件下生長速率顯著減緩，并在對數(shù)期生長速率差異明顯。

The density of bacteria is 10-5to 10-1, approximately 2×102to 2×106cells/mL. 3 μL bacteria at different density were added into every grid.

圖1敲低菌株在固體培養(yǎng)基中生長減緩
Fig.1GrowthofICD-KDstrainsinsolidmedium

The initialOD600of bacteria is about 0.02. At log phase, the growth rate of ICD-KD strains was lower than vector strains.

圖2敲低菌株在液體培養(yǎng)基中生長減緩
Fig.2GrowthofICD-KDstrainsinliquidmedium

2.3 icd轉(zhuǎn)錄水平檢測

在無水四環(huán)素誘導(dǎo)下，敲低成功的ICD-KD菌體內(nèi)目的基因轉(zhuǎn)錄水平降低。同樣條件下培養(yǎng)細(xì)菌，抽提等量菌體內(nèi)RNA檢測目的基因轉(zhuǎn)錄水平(圖 3)。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)入空載的恥垢分枝桿菌相比，ICD-KD菌株在加入無水四環(huán)素誘導(dǎo)后MSMEG_1654基因轉(zhuǎn)錄水平顯著降低(P<0.001)，表明菌體內(nèi)icd轉(zhuǎn)錄受到影響。

2.4 ICD蛋白表達(dá)水平檢測

在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌，約24 h后達(dá)對數(shù)期。將此時的菌體超聲破碎離心，取上清液測定總蛋白濃度，檢測ICD蛋白表達(dá)水平(圖 4)。上樣量為50 μg時，全菌蛋白的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)條帶基本一致，無明顯差異。蛋白免疫印跡檢測結(jié)果表明，在無水四環(huán)素誘導(dǎo)下，與轉(zhuǎn)入空載的菌株相比，ICD-KD菌株中ICD表達(dá)水平顯著降低。

The transcriptional level ofMSMEG_1654 in ICD-KD strains cultured with ATc was significantly decreased compared to other strains.

圖3敲低菌株的MSMEG_1654轉(zhuǎn)錄水平
Fig.3RelativetranscriptionallevelofMSMEG_1654inICD-KDstrains

The anti-ICD polyclonal antibody was used in Western blotting. ICD expression in ICD-KD strains was significantly decreased compared to wild-type strains and ICD-KD strains without ATc. DosR was used as an internal reference. The molecular weight of ICD protein is about 86.2 kDa, and that of DosR is about 23 kDa.

圖4敲低菌株的ICD蛋白表達(dá)水平
Fig.4ProteinexpressionofICDinICD-KDstrains

2.5 ICD酶活測定

取2.4中不同培養(yǎng)條件獲得的全菌蛋白，檢測ICD酶活水平(圖 5)。在無水四環(huán)素存在時，ICD-KD菌株的全菌ICD酶活水平顯著降低(P<0.000 1)，與ICD轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平檢測結(jié)果相符。

綜合上述結(jié)果，表明恥垢分枝桿菌ICD-KD菌株構(gòu)建成功，ICD低轉(zhuǎn)錄、低表達(dá)，酶活也受到抑制，嚴(yán)重影響恥垢分枝桿菌的生長繁殖，與野生型細(xì)菌相比，ICD-KD菌株生長緩慢。

ICD enzyme activity in ICD-KD strains cultured in medium containing ATc was decreased compared to ICD-KD strains without ATc.

圖5敲低菌株的相對ICD酶活水平
Fig.5RelativeICDenzymeactivityinICD-KDstrains

3 討論

目前，基因功能研究方法包括啟動子置換和誘導(dǎo)型蛋白降解系統(tǒng)，可使目的基因表達(dá)水平發(fā)生改變[14-16]，但可能需幾個月才能靶向單個基因。轉(zhuǎn)座子測序(transposon sequencing, Tn-seq)允許同時評估數(shù)十萬個功能喪失突變體，但在結(jié)核分枝桿菌中不能做到人為調(diào)控表達(dá)水平，無法操縱重要基因[5]。此外，這些方法不能提供簡單的機(jī)制來同時調(diào)節(jié)多個基因以闡明遺傳相互作用[9]。對分枝桿菌基因功能的研究主要依賴目的基因敲除，但分枝桿菌菌體內(nèi)缺少重組酶，同源重組率非常低，基因敲除難度相對較大，特別是對必需基因的功能研究更是一個瓶頸。本研究使用CRISPRi技術(shù)，非常簡單方便，只需構(gòu)建含有特異sgRNA的單一質(zhì)粒(sgRNA骨架)并轉(zhuǎn)化入分枝桿菌[17]。sgRNA骨架的構(gòu)建也十分快捷。CRISPRi是誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄干擾，可操作一些比較重要的基因，不受必需基因的限制。相比直接基因敲除，其更可控[18-20]。通過改變靶定的PAM區(qū)，可調(diào)節(jié)CRISPRi對轉(zhuǎn)錄的抑制水平，從而改變基因敲低的幅度。但CRISPRi存在一些不足，如極性效應(yīng)：dCas9靶定位點下游與靶定基因處于同一操縱子內(nèi)的所有基因轉(zhuǎn)錄都將被抑制[9]。

ICD是TAC中的關(guān)鍵限速酶。碳通量通過其底物異檸檬酸進(jìn)入代謝通路，是分枝桿菌脂肪酸代謝的重要途徑。已有研究表明，結(jié)核分枝桿菌的碳代謝過程對其致病能力起重要作用[21]。在代謝不同碳源時，結(jié)核分枝桿菌和恥垢分枝桿菌的ICD酶活水平發(fā)生改變[4]。研究分枝桿菌代謝碳源的機(jī)制有利于新型抗結(jié)核藥物的開發(fā)。有研究發(fā)現(xiàn)，在恥垢分枝桿菌中敲除MSMEG_1654會導(dǎo)致細(xì)菌發(fā)生谷氨酰胺表型缺陷，即無法在沒有添加谷氨酰胺的培養(yǎng)基中生存[4]。因此，本研究采用CRISPRi技術(shù)使細(xì)菌不產(chǎn)生表型缺陷，并能適當(dāng)降低目的基因表達(dá)水平[22]。

本研究中，MSMEG_1654基因與上下游基因均不位于同一操縱子，因此利用CRISPRi的轉(zhuǎn)錄抑制可發(fā)揮穩(wěn)定作用，不必考慮極性效應(yīng)的影響。恥垢分枝桿菌中MSMEG_1654敲低后，基因轉(zhuǎn)錄水平大幅降低，蛋白表達(dá)水平也明顯下降， ICD酶活顯著降低。MSMEG_1654是必需基因，表達(dá)被抑制時會對細(xì)菌生長造成影響。因此，在固體培養(yǎng)基中添加無水四環(huán)素誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄抑制時，敲低菌株的生長明顯減慢。必需基因敲低后會明顯影響細(xì)菌生長，這也是應(yīng)用CRISPRi技術(shù)敲低必需基因的顯著特征。后續(xù)研究將繼續(xù)探索ICD在TAC及碳源代謝中的具體功能和機(jī)制，如細(xì)菌在代謝不同碳源過程中ICD的作用，并進(jìn)一步分析分枝桿菌ICD在碳源代謝和碳通量分流調(diào)控中的作用。本研究利用CRISPRi技術(shù)快速敲低恥垢分枝桿菌必需基因的方法，也為后續(xù)結(jié)核分枝桿菌必需基因的敲低和功能研究開展提供了重要基礎(chǔ)。