張逸，王曉雯，李若瑜

北京大學第一醫(yī)院皮膚性病科，北京大學真菌與真菌病研究中心，皮膚病分子診斷北京市重點實驗室，北京 100034

真菌是一類廣泛存在于人類生存環(huán)境中的真核生物，大多數屬于機會性致病菌。即當宿主免疫功能出現異常時，機體無法有效清除真菌，導致皮膚、黏膜、皮下及系統(tǒng)性真菌感染。近年來，隨著真菌感染性疾病特別是侵襲性深部真菌病的發(fā)病率日益增多，有關真菌感染發(fā)生機制及宿主抗真菌免疫機制的研究成為熱點。胱天蛋白酶募集域蛋白 9(caspase recruitment domain-containing protein 9，CARD9)屬于 CARD 家族中的一員，是Bertin等[1]研究CARD時發(fā)現的一個重要銜接蛋白，高度表達于髓細胞，尤其是樹突細胞和巨噬細胞中。自2009年首次報道慢性皮膚黏膜念珠菌病患者中存在CARD9突變以來[2]，陸續(xù)有報道表明CARD9突變可導致多種真菌易感性明顯增加[3-8]。本文就近年來CARD9基因突變在真菌感染性疾病中的研究進展進行綜述。

1 真菌感染性疾病概述

真菌屬于異養(yǎng)真核腐生生物，具有真正的細胞器和細胞核，廣泛存在于自然界中。盡管已知真菌種屬超過100萬種，但僅極少數種屬的真菌被證實具有致病性，可導致免疫正常個體致病。多數種屬的真菌屬于機會性致病菌，僅在機體免疫狀態(tài)改變、物理屏障破壞或正常菌群平衡被破壞時才致病。近年來，隨著醫(yī)療介入性操作、機體微生物組分發(fā)生紊亂(如長期使用廣譜抗生素等)、造血干細胞移植和實體器官移植、化學治療、長程及大劑量接受免疫抑制劑治療及人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染等危險因素增多，真菌感染特別是侵襲性真菌感染成為目前人類疾病譜中高發(fā)病率和高病死率的重要病種，特別是在免疫受損個體，嚴重威脅高危人群的生命安全[9-10]。

2 CARD9概述

CARD9定位于染色體 9q34.3，包含 2 108 bp 的 cDNA，可編碼536個氨基酸殘基、相對分子質量為 62 300 的蛋白。CARD9具有兩個重要功能區(qū)域(圖1)：N端區(qū)域和C端區(qū)域。前者具有胱天蛋白酶募集功能，有7～98個氨基酸殘基；后者具有寡聚化作用，由7肽重復特征的卷曲螺旋域組成，至少有 3個，分別為第140～230位、第243～277位、第332～419位的卷曲螺旋域，這些卷曲螺旋域行使蛋白質寡聚化功能[1]。CARD9存在于人體多種組織中，如脾、肝、胎盤、肺、腦等，并高度表達于髓細胞尤其是骨髓源巨噬細胞和骨髓源樹突細胞中[11-12]。

圖1CARD9結構域(CARD結構域和卷曲螺旋結構域)[1]
Fig.1DomainstructureofCARD9showingCARDdomain(residues7-98)andcoiled-coildomain(residues140-420)[1]

CARD9能高效整合多種天然免疫受體的識別信號，在機體抗真菌免疫中發(fā)揮重要作用。CARD9可通過其寡聚化結構域與天然免疫蛋白Bcl-10、黏膜相關淋巴組織淋巴瘤轉運蛋白1(mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation protein 1，MALT-1)結合并形成CARD9-Bcl-10-MALT-1(CBM)復合體，作為C型凝集素受體(C-type lectin receptor，CLR)等受體通路的重要媒介，激活核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)等炎癥信號通路，進而激活下游信號分子，促進炎癥因子產生[12-14]。

3 CARD9基因突變與真菌感染性疾病

CARD9存在于人類免疫細胞胞質中，作為Dectin-1、Dectin-2、Dectin-3和巨噬細胞誘導型C型凝集素(macrophage-inducible C-type lectin，Mincle)等CLR細胞表面模式識別受體的下游關鍵連接蛋白[15]，接收識別受體的轉導信號，并通過其寡聚化結構域與多種分子形成復合物，從而介導下游抗真菌免疫應答產生[15-16]。其介導的信號通路被認為是連接宿主抗真菌天然免疫與適應性免疫的橋梁[3]。迄今為止，全世界已報道14個國家共計56例患者發(fā)生18種CARD9基因改變。這些患者均表現為選擇性地對某種真菌易感，引起多種真菌感染性疾病，包括念珠菌病(22例)、皮膚癬菌病(22例)、暗色真菌感染(10例)、肺外曲霉病(2例) 。

3.1 CARD9基因突變與念珠菌感染

迄今為止，共有來自7個國家的22例CARD9基因突變患者感染念珠菌[2,3,5,8,17-21]，其中8例發(fā)生無義突變，涉及的突變位點有p.Q295X[2,8,17-18]和p.Q289X[18]，均為純合突變；10例發(fā)生錯義突變，涉及的突變位點有p.R373P[3]、p.G72S[3]、p.Y91H[5,19]、p.R70W[18,21]、p.R35Q[18]、p.R57H[20]，雜合突變與純合突變均存在；其余4例突變類型未被提及。9例患者CARD9蛋白C端結構發(fā)生改變，9例CARD9蛋白N端結構發(fā)生改變。CARD9基因突變引起念珠菌感染患者多發(fā)生慢性皮膚黏膜念珠菌病及念珠菌中樞神經系統(tǒng)感染(念珠菌性腦膜炎)，少數累及鼻竇、結腸和脊髓。感染的念珠菌類型幾乎都是白念珠菌，僅1例為光滑念珠菌。此類患者多在幼年發(fā)病，之后出現相應部位念珠菌感染癥狀遷延不愈，甚至威脅生命。22例患者中，14例患者的父母為近親結婚，符合CARD9基因為常染色體隱性遺傳的特點。

由于CARD9基因突變，患者的抗真菌免疫功能發(fā)生障礙，外周血中性粒細胞存在吞噬能力缺陷，有些念珠菌中樞神經感染患者出現中樞神經系統(tǒng)中性粒細胞數量減少的現象，同時大部分患者外周血促炎因子如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細胞介素6(interleukin 6，IL-6)、IL-1β、IL-8、IL12p70、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)等分泌減少，有些患者外周血Th17細胞數量減少。

針對患者體內抗真菌免疫細胞因子分泌減少，Gavino等[5]對4例復發(fā)性白念珠菌性腦膜炎進行GM-CSF輔助治療，患者于6 d內有所改善，腦脊液細胞、蛋白及糖類水平逐漸恢復正常?；颊吖步邮蹽M-CSF治療18個月，癥狀緩解。Celmeli等[17]對1例念珠菌性腦膜炎患者皮下注射粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)后，患者癥狀有所緩解，腦脊液相關指標逐漸恢復，體內IL-17分泌水平趨于正常(表1)。

3.2 CARD9基因突變與皮膚癬菌感染

CARD9基因突變者還有可能發(fā)生嚴重的皮膚癬菌感染。截至目前，共報道6個國家的22例CARD9基因突變導致的皮膚癬菌感染[4,7,21-24]。其 中14例發(fā)生無義突變，突變位點均為p.Q289X[4,22,24]，均為純合突變；4例發(fā)生錯義突變，涉及的突變位點有p.R101C[4]、p.R101L[7]、p.R70W[21]，均為純合突變；其余4例突變類型未提及。CARD9基因突變引起的皮膚癬菌感染不僅累及淺表皮膚、甲、頭皮等，還可累及淋巴結、中樞神經系統(tǒng)等部位發(fā)生深部皮膚癬菌病或引起全身泛發(fā)的皮膚癬菌病。與念珠菌感染患者相似，此類患者也具有發(fā)病早、病程遷延不愈，甚至威脅生命的特點。感染的皮膚癬菌類型主要有紅色毛癬菌、紫色毛癬菌、須癬毛癬菌及疣狀毛癬菌。22例患者中，17例患者的父母為近親結婚，高于念珠菌感染患者中的比例。

由于CARD9基因缺陷，患者外周血促炎因子IL-6等分泌減少，Th17細胞數量不足，導致患者在天然免疫和適應性免疫兩個層面均出現抗真菌能力不足，最終表現為頑固的難治性真菌感染(表2)。

3.3 CARD9基因突變與暗色真菌感染

暗色真菌也稱為“黑酵母”，包含一大類以細胞壁存在黑色素顆粒為特征的病原性真菌，呈世界性分布，主要發(fā)現于土壤中。暗色真菌可導致免疫正常和免疫異常個體出現眾多慢性皮膚、皮下組織的系統(tǒng)或播散性真菌性感染性疾病，包括暗色絲孢霉病、著色芽生菌病和足菌腫[25-27]。截至目前，共報道10例CARD9基因突變相關暗色真菌感染病例，其中8例由我國報道[6,28-29]。

Wang等[6]報道4例疣狀瓶霉感染導致的頑固性難治皮下型暗色絲孢霉病，患者均存在CARD9基因突變及Th17數量和功能缺陷。其中1例患者CARD9基因突變類型為雜合突變p.L64fsX59和p.Q158X，另外3例患者為純合移碼突變p.D274fsX60。4例患者CARD9基因在mRNA水平均正常表達，而在蛋白水平表達缺失?；颊叩臉渫患毎途奘杉毎嬖诖傺滓蜃?IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-23p19)分泌障礙，同時外周血Th17細胞數量減少、IL-17和IL-22分泌減少。該研究首次確定了CARD9基因突變與暗色絲孢霉病的關系，并對患者免疫功能進行了初步探討，有利于進一步研究CARD9基因突變與真菌感染性疾病之間的關系。

Lanternier等[30]報道2例散發(fā)的CARD9基因突變所致外瓶霉感染。1例來自安哥拉的患者5歲時出現肝臟和中樞神經系統(tǒng)的皮炎外瓶霉感染，其CARD9基因突變類型為純合錯義突變p.R18W，CARD9蛋白表達完整但功能缺失，導致外周血促炎因子分泌減少，NF-κB轉錄水平降低，而IL-17產生能力正常。另1例來自伊朗的患者18歲時出現皮下、骨骼及肺部棘狀外瓶霉感染，其CARD9基因突變類型為p.E232del。

張瑞珺等[28]報道了1例疣狀瓶霉感染所致暗色絲孢霉病，由皮膚及皮下組織暗色絲孢霉病逐漸進展為播散性暗色絲孢霉病(圖2)?；颊逤ARD9基因存在新的復合雜合錯義突變(p.R35Q 和p.E81K)，CARD9 蛋白表達正常，外周血淋巴細胞(peripheral blood lymphocyte，PBL)和Th1/Th17細胞比例均降低，外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)抗疣狀瓶霉感染存在天然及適應性免疫缺陷， 導致無法清除病原性真菌，病程遷延進展達10年余(表3)。

A: In 2006, the lesions were located in the left ear. B: In 2009, the lesions extended to the face, ear and back. C: In 2011, the infectious lesions could be found in the face, back, left upper limb and chest. D: In 2015, septate hyphae were visible in the oral cavity and maxillary secretions of the patient (direct microscopic examination, ×400).

圖2CARD9基因突變患者皮膚及皮下組織暗色絲孢霉病的臨床進展照片及真菌直接鏡檢結果[28]
Fig.2Clinicalmanifestationsoftheskinandsubcutaneousphaeohyphomycosisoverthepasttenyearsanddirectmicroscopicexaminationresultsoffungi[28]

Liang等[31-32]研究CARD9基因缺陷患者，體外細胞實驗顯示CARD9參與中性粒細胞抗疣狀瓶霉過程中細胞因子TNF-α、IL-8、IL-6的表達。研究發(fā)現，疣狀瓶霉感染的CARD9基因缺陷患者外周血中性粒細胞功能存在部分缺陷，包括針對疣狀瓶霉孢子的殺傷功能減弱，促炎因子分泌減少，而這種抵抗疣狀瓶霉感染的免疫功能缺陷可被血清調理作用進行補償。

最近， Wang等[29]又報道了3例皮下組織暗色絲孢霉病，分別由棘狀外瓶霉、馬薩埃指霉及多主棒孢霉感染引起。3例患者均存在CARD9基因突變，其中 p. S23X為新發(fā)突變，p.D274fsX60和p.L64fsX59為已發(fā)突變，導致野生型CARD9 蛋白表達缺乏?；颊咄庵苎庖呒毎浵鄳瞪婢碳ず?，促炎因子、趨化因子、NF-κB活性及Th17和Th22相關免疫反應受損，但吞噬能力和活性氧生成能力均未見缺乏。

Wu等[33]利用CARD9基因敲除小鼠建立疣狀瓶霉感染的暗色絲孢霉病模型，模擬CARD9缺陷患者的疣狀瓶霉感染。結果發(fā)現，CARD9基因敲除小鼠疣狀瓶霉易感性明顯增加，感染后期還可發(fā)生腦、肺、肝、脾、腎、淋巴結等全身多系統(tǒng)播散，死亡率為100%。

3.4 CARD9基因突變與曲霉感染

Rieber等[34]報道2例侵襲性肺外曲霉感染患者，分別在8歲和18歲時出現肺外曲霉感染癥狀。其中1例患者于12歲出現腹腔內曲霉感染而死亡，存在CARD9基因純合突變M1I/M1I；另外1例患者從9歲開始陸續(xù)出現腹腔內念珠菌病及中樞神經系統(tǒng)和腹腔內曲霉感染，存在CARD9基因純合突變Q295X。2例患者均存在CARD9蛋白表達缺失?；颊咄庵苎袉魏思毎?、中性粒細胞和Th17細胞數量正常， 中性粒細胞的吞噬殺傷能力未見異常，但單核細胞在真菌刺激后表現為促炎因子分泌減少，同時感染部位的中性粒細胞數量減少，可能與CARD9基因突變導致的肺外組織趨化因子生成減少有關。

4 結語

CARD9基因突變會引起不同真菌感染，主要機制涉及以下幾點。①中性粒細胞參與組成宿主抗真菌感染的第一道防線，CARD9缺陷影響中性粒細胞募集和相應趨化因子分泌，患者出現中性粒細胞數量減少及效應減弱，從而導致真菌清除困難。②CARD9缺陷患者抗真菌感染天然免疫相關促炎因子分泌嚴重缺乏(如IL-6、IL-1β、TNF-α等)，影響下游適應性免疫中效應細胞Th1和Th17分化。③適應性免疫尤其是Th1和Th17細胞免疫在真菌免疫中發(fā)揮重要作用，Th1細胞效應因子γ干擾素(interferon γ，IFN-γ)可增強巨噬細胞對真菌的吞噬殺傷作用，Th17細胞效應因子IL-17可誘導集落刺激因子及趨化因子產生，調節(jié)中性粒細胞募集，增加抗微生物多肽分泌，從而增強宿主免疫防御。然而，大部分CARD9缺陷患者外周血中Th1/Th17細胞比例降低，效應因子分泌缺乏，導致患者出現真菌感染。

目前報道的CARD9基因突變所致真菌感染患者多有發(fā)病較早、父母近親結婚、病程遷延不愈、抗真菌免疫功能障礙等共同特點，感染的病原體類型涉及念珠菌、皮膚癬菌、暗色真菌及曲霉等。高度提示，如果在臨床工作中發(fā)現患者具有以上特點，應積極篩查其遺傳免疫缺陷，從而為后續(xù)病因診斷和治療提供重要指導。

隨著CARD9缺陷患者真菌感染的報道逐漸增多，發(fā)現他們往往具有僅感染某一類或幾類真菌的特點，是否不同真菌表面成分的不同對CARD9信號通路的作用有差異，有待進一步研究。未來可通過對不同真菌成分及毒力的研究，對宿主抗真菌免疫的深入認識，以及遺傳學的不斷探索，這些問題可能會一一得到解決。