羅斌，錢凱，徐萬(wàn)祥，唐海平，季朝能，謝毅，顧少華

1. 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳學(xué)研究所，上海 200438； 2. 上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所國(guó)家人口和計(jì)劃生育委員會(huì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032； 3. 上海市工業(yè)菌株工程技術(shù)研究中心，上海 200438

根據(jù)甲型流感病毒(influenza A virus，IAV)兩個(gè)主要膜蛋白血凝素(hemagglutinin，HA)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，NA)的不同，分為18個(gè)HA亞型和11個(gè)NA亞型[1-2]。甲型流感病毒通過HA與宿主細(xì)胞表面的唾液酸受體結(jié)合進(jìn)入候鳥、家禽、豬和人等宿主。由于不同種屬唾液酸受體的結(jié)構(gòu)不同，甲型流感病毒存在種屬特異性，難以跨種屬傳播，有禽流感病毒、豬流感病毒和人流感病毒之分[3-4]。甲型流感病毒的最初宿主為禽類[5]，其HA發(fā)生突變后就可能跨種屬傳播，因此禽流感病毒為甲型流感的元兇。

目前研制禽流感疫苗的策略是：每年根據(jù)流行病學(xué)監(jiān)測(cè)進(jìn)行預(yù)測(cè)，大約提前6個(gè)月決定疫苗所用的禽流感病毒株；針對(duì)所用病毒株的HA和NA編碼基因制備新的禽流感疫苗，以匹配可能流行的禽流感病毒[6]。由于HA和NA編碼基因極易發(fā)生突變，或因不同亞型病毒株之間基因重配，目前尚難以對(duì)將要流行或暴發(fā)的禽流感病毒株進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)測(cè)，所以研制對(duì)不同禽流感病毒具有廣譜作用的疫苗極其重要。

基質(zhì)蛋白2(matrix protein 2，M2)是禽流感病毒的第3個(gè)膜蛋白[7]，其N端1～24位殘基為M2胞外區(qū)(M2 ectodomain，M2e)。M2e在不同亞型禽流感病毒之間高度保守[8]，是研制廣譜性禽流感疫苗的靶標(biāo)之一，但其免疫原性較弱[9]?；魜y弧菌腸毒素亞單位A1(Vibriocholeraeenterotoxin subunit A1，CTA1)和來(lái)自金黃色葡萄球菌蛋白A的兩個(gè)Ig結(jié)合域(two Ig-binding domains，DD)串聯(lián)組成的CTA1-DD能起黏膜免疫佐劑作用[10-11]。本課題組前期研究中獲得4種以禽類為宿主的M2e多肽序列(M2e1：SLLTEVETPTRNGWESKSSDSSD；M2e2：SLLTEVETPTRNEWESRSSDSSD；M2e3：SLLTEVETPTRNGWESRSSDSSD；M2e4：SLL-TEVETPTRNEWESKSSDSSD)，并將其與腸炎沙門菌鞭毛蛋白(Salmonellaentericflagellin，Sef；Accession No：WP_000079833.1)融合構(gòu)建成的Sef4M2e注射小鼠，發(fā)現(xiàn)具有體液免疫效果(未發(fā)表)。在此基礎(chǔ)上，本研究將這4種M2e多肽序列與CTA1-DD串聯(lián)，構(gòu)成重組蛋白CTA1DD-AVI4M2e，探討其黏膜免疫和體液免疫效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株、重組質(zhì)粒和蛋白大腸埃希菌BL21(DE3)為本實(shí)驗(yàn)室保存。pET-28a(+)-CTA1DD-AVI4M2e重組質(zhì)粒由上海旭冠生物科技發(fā)展有限公司合成，pXXGST-2、pXXGST188-M2e1、pXX-GST188-M2e2、pXXGST188-M2e3和pXXGST188-M2e4質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存。Sef4M2e蛋白為本實(shí)驗(yàn)室保有(其特征是在Sef的C端融合4M2e)，M2e1、M2e2、M2e3和M2e4多肽(1 mg/mL，純度>90%)由合肥博肽生物科技有限公司合成。

1.1.2主要試劑6×His單克隆抗體、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgA和IgG購(gòu)自Abcam公司，蛋白酶抑制劑購(gòu)自Roche公司，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購(gòu)自上海冠泰生物科技有限公司。

1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物45只6周齡BALB/c雄性小鼠及標(biāo)準(zhǔn)小鼠飼料購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。每15只分籠飼養(yǎng)于上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所普通級(jí)小鼠動(dòng)物房?jī)?nèi)，室溫(20±2) ℃，并保證良好的通風(fēng)和光照條件。

1.2 方法

1.2.1原核表達(dá)載體pET-28a(+)-CTA1DD-AVI4M2e構(gòu)建根據(jù)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)提供的CTA1(Accession No：P01555)和DD(Accession No：AAB05743)序列，組成CTA1DD序列，再將4個(gè)禽流感M2e序列串聯(lián)在CTA1DD下游，利用常見的GPGP和GG寡肽作為連接接頭，構(gòu)成CTA1DD-GPGP-M2e1-GG-M2e2-GG-M2e3-GG-M2e4，由上海旭冠生物科技發(fā)展有限公司進(jìn)行全合成，并在上下游分別引入EcoRⅠ和HindⅢ的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，插入pET-28a(+)載體，構(gòu)成重組質(zhì)粒pET-28a(+)-CTA1DD-AVI4M2e。

1.2.2重組融合蛋白的表達(dá)、優(yōu)化、鑒定與純化將重組質(zhì)粒pET-28a(+)-CTA1DD-AVI4M2e轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3)，在含有終濃度為50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8，加入終濃度為1 mmol/L 的異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG)，分別于16 ℃誘導(dǎo)24 h、25 ℃誘導(dǎo)8 h和37 ℃誘導(dǎo)4 h優(yōu)化表達(dá)條件。取1 mL菌液，12 000 r/min離心1 min，收集菌體，按1∶10(質(zhì)量體積比)加入磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)重懸，用超聲破碎儀破菌，離心分別收集上清液和沉淀。分別將pXXGST-2質(zhì)粒和4個(gè)pXXGST188-M2e質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3)，在含有終濃度為50 μg/mL氨芐西林的LB液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)至OD600為 0.6～0.8，42 ℃ 誘導(dǎo)4 h，收菌制樣，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)和蛋白免疫印跡分析。待重組蛋白實(shí)驗(yàn)結(jié)果和優(yōu)化條件確定后進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)，收集誘導(dǎo)后的菌體，以Start Buffer(含10 mmol/L咪唑)重懸，用破菌儀破菌3次，離心后將上清液經(jīng)鎳柱親和層析，探索合適比例的Elution Buffer(含250 mmol/L咪唑)洗脫雜蛋白，然后進(jìn)行梯度洗脫目的蛋白，最后超濾管濃縮、換液，獲得高濃度重組蛋白。以Image J軟件對(duì)目的蛋白進(jìn)行灰度分析，將分裝好的蛋白于液氮中迅速凍存后保存在-80 ℃冰箱。

1.2.3灌服免疫BALB/c小鼠將目的蛋白和Sef4M2e蛋白用1×PBS稀釋至適宜濃度，加入終濃度為1%的明膠，最終每只小鼠灌服體積為200 μL。小鼠灌服前24 h斷食斷水，灌服前30 min灌服30 μL含10% NaHCO3的水溶液。第1組小鼠每只灌服CTA1DD-AVI4M2e蛋白200 μg，第2組小鼠每只灌服CTA1DD-AVI4M2e蛋白和Sef4M2e蛋白各100 μg，第3組為空白組，每只灌服相應(yīng)體積含1%明膠的1×PBS溶液。小鼠灌服2 h后恢復(fù)食物和水的供給。每周灌服1次，共4次。

1.2.4免疫后小鼠腸液和血清制備最后一次灌服后第10天，以摘眼球方式獲取小鼠血液，待血液流盡后斷頸處死小鼠，用解剖剪剪開腹腔，自胃以下部位依次剪取3段腸樣，每段約5 cm。采集的血液于37 ℃靜置1 h，4 ℃冰箱過夜，5 000 r/min低溫離心10 min，吸取血清置于無(wú)菌EP管中。將小鼠腸樣置于1.5 mL無(wú)菌EP管，加入500 μL含2%蛋白酶抑制劑的1×PBS，用無(wú)菌剪刀剪碎后，將EP管置于旋渦振蕩器振蕩10 min，最后4 ℃離心吸取上清液置于新的無(wú)菌EP管。將獲取的每個(gè)樣品按小鼠實(shí)驗(yàn)分組做好標(biāo)記，保存于-80 ℃冰箱待檢測(cè)。

1.2.5ELISA免疫原性分析將重組融合蛋白CTA1DD-AVI4M2e按50 ng/孔包被96孔板，待檢測(cè)樣品分別按1∶40、1∶120、1∶360、1∶1 080、1∶3 240、1∶9 720 的比例，用ELISA試劑盒中的血清稀釋液和非血清稀釋液稀釋。以稀釋后的樣品作為一抗，200 μL/孔加至酶標(biāo)板，37 ℃孵育1 h，以HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgA作為腸液二抗、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG作為血清二抗，按1∶10 000 稀釋后進(jìn)行ELISA檢測(cè)，測(cè)量OD450值。

1.2.6M2e特異性鑒定本研究所用蛋白為融合蛋白，為進(jìn)一步驗(yàn)證其產(chǎn)生的IgA抗體對(duì)4個(gè)M2e的特異性，將分別表達(dá)4個(gè)GST188-M2e的全菌裂解液作為實(shí)驗(yàn)組，由pXXGST-2表達(dá)的截短GST188作為對(duì)照組，以隨機(jī)抽取的5個(gè)腸液樣品稀釋200倍后的腸液IgA抗體作為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgA按1∶10 000 稀釋作為二抗，進(jìn)行蛋白免疫印跡分析。將4個(gè)合成的M2e多肽和Sef4M2e按50 ng/孔包被96孔板，以隨機(jī)抽取的5個(gè)腸液樣品稀釋200倍后的腸液IgA抗體作為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgA按1∶10 000 稀釋作為二抗，進(jìn)行ELISA檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 重組蛋白原核表達(dá)、優(yōu)化與鑒定

將pET-28a(+)-CTA1DD-AVI4M2e質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，誘導(dǎo)表達(dá)后破碎菌體，用10% SDS-PAGE檢測(cè)誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后裂解上清液和全菌蛋白質(zhì)。結(jié)果如圖1所示，于 55 000～70 000 出現(xiàn)誘導(dǎo)條帶。以1∶3 000 稀釋的anti-His抗體為一抗、1∶10 000 稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG為二抗進(jìn)行蛋白免疫印跡鑒定。結(jié)果如圖2所示，出現(xiàn)目的蛋白，優(yōu)化后的誘導(dǎo)條件為1 mmol/L IPTG，25 ℃誘導(dǎo)8 h。

Lane 1: pre-stained protein marker; Lane 2: uninduced cell lysates at 16 ℃; Lane 3: induced cell lysates at 16 ℃ for 24 h; Lane 4: induced cell lysates supernatant at 16 ℃ for 24 h; Lane 5: uninduced cell lysates at 25 ℃; Lane 6: induced cell lysates at 25 ℃ for 8 h; Lane 7: induced cell lysates supernatant at 25 ℃ for 8 h; Lane 8: uninduced cell lysates at 37 ℃; Lane 9: induced cell lysates at 37 ℃ for 4 h; Lane 10: induced cell lysates supernatant at 37 ℃ for 4 h.

圖1重組蛋白CTA1DD-AVI4M2e誘導(dǎo)表達(dá)及優(yōu)化結(jié)果
Fig.1ExpressionandoptimizationofrecombinantproteinCTA1DD-AVI4M2e

Lane 1: pre-stained protein marker; Lane 2: uninduced cell lysates at 25 ℃; Lane 3: induced cell lysates at 25 ℃ for 8 h; Lane 4: induced cell lysates supernatant at 25 ℃ for 8 h.

圖2重組蛋白CTA1DD-AVI4M2e蛋白免疫印跡結(jié)果
Fig.2WesternblottingresultsofrecombinantproteinCTA1DD-AVI4M2e

2.2 重組蛋白純化結(jié)果

大量表達(dá)目的蛋白后，以高壓破菌儀重復(fù)破碎3次，高速離心后獲得大量含重組蛋白的上清液，經(jīng)過鎳柱親和層析，探索出合適的蛋白純化條件為用14% Elution Buffer和86% Start Buffer洗除雜蛋白。設(shè)置15 mL梯度洗脫長(zhǎng)度和100% Elution Buffer洗脫目標(biāo)，收取目的蛋白后進(jìn)行兩次換液濃縮，獲得重組目的蛋白(圖3)。對(duì)SDS-PAGE圖第2泳道進(jìn)行灰度分析，目的蛋白純度約為 89.81%。

Lane 1: pre-stained protein marker; Lane 2: purified protein after the second concentration; Lane 3: purified protein after the first concentration.

圖3CTA1DD-AVI4M2e純化和濃縮結(jié)果
Fig.3PurificationandconcentrationofrecombinantproteinCTA1DD-AVI4M2e

2.3 ELISA免疫原性分析結(jié)果

對(duì)小鼠免疫后的血清樣品和腸樣浸出液進(jìn)行ELISA檢測(cè)，以實(shí)驗(yàn)組OD值高于空白對(duì)照組2倍作為有效稀釋效價(jià)(表1)。用GraphPad Prism 6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t-test雙尾檢驗(yàn)，P<0.01 為差異有顯著意義。

表1樣品效價(jià)
Tab.1Sampletiterresults

GroupsSampleTitersGroup 1Serum IgG360×First segmented intestinal fluid IgA360×Second segmented intestinal fluid IgA120×Third segmented intestinal fluid IgA9 720×Group 2Serum IgG360×First segmented intestinal fluid IgA120×Second segmented intestinal fluid IgA120×Third segmented intestinal fluid IgA3 240×

如表1所示，第1組中血清IgG效價(jià)達(dá)360倍，第1段腸液IgA效價(jià)達(dá)360倍，第2段腸液IgA效價(jià)達(dá)120倍，第3段腸液IgA效價(jià)達(dá) 9 720 倍；第2組中血清IgG效價(jià)達(dá)360倍，第1段腸液IgA效價(jià)達(dá)120倍，第2段腸液IgA效價(jià)達(dá)120倍，第3段腸液IgA效價(jià)達(dá) 3 240 倍。

本課題組前期用Sef4M2e蛋白對(duì)小鼠進(jìn)行注射免疫獲得了較理想的效果(未發(fā)表)，本研究為探尋其與CTA1DD-AVI4M2e的協(xié)同免疫效果，檢測(cè)腸道IgA抗體。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠體內(nèi)均產(chǎn)生了特異性IgA抗體，但從OD值判斷，第1組產(chǎn)生的抗體效價(jià)較高，可初步判斷Sef4M2e不能與CTA1DD-AVI4M2e產(chǎn)生協(xié)同作用而誘導(dǎo)更多的特異性IgA抗體產(chǎn)生。同時(shí)，第1組中CTA1DD-AVI4M2e融合蛋白免疫劑量為200 μg，第2組為100 μg，結(jié)果顯示第1組抗體效價(jià)高于第2組，表明此融合蛋白產(chǎn)生的抗體效價(jià)與免疫劑量呈正相關(guān)(圖4)。

圖5顯示，小鼠各段腸液中IgA抗體效價(jià)不一樣，但呈現(xiàn)共同的趨勢(shì)，即小鼠腸黏膜產(chǎn)生的抗體效價(jià)在第3段最高，第1段次之，第2段最低，且第3段腸液中抗體效價(jià)隨稀釋倍數(shù)增加緩慢下降，而第1段和第2段中抗體效價(jià)隨稀釋倍數(shù)增加迅速下降。

2.4 M2e特異性鑒定結(jié)果

蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，由CTA1DD-AVI4M2e免疫產(chǎn)生的腸液IgA抗體能分別與4個(gè)M2e多肽發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，且能與Sef4M2e中的4M2e發(fā)生免疫反應(yīng)，結(jié)果如圖6～7所示。

A-C: IgA titer of segmented intestine. D: IgG titer of serum.

Group 1: 200 μg (200 μL) of CTA1DD-AVI4M2e protein was given; Group 2: 100 μg (200 μL) of CTA1DD-AVI4M2e protein and 100 μg of Sef4M2e protein were given; Group 3: 200 μL of 1% gelatin in PBS was given.

圖4腸液特異性IgA抗體和血清特異性IgG抗體ELISA結(jié)果
Fig.4ELISAresultsofintestinalfluid-specificIgAandserum-specificIgG

A: IgA titer of segmented intestine in group 1. B: IgA titer of segmented intestine in group 2.

Group 1: 200 μg (200 μL) of CTA1DD-AVI4M2e protein was given; Group 2: 100 μg (200 μL) of CTA1DD-AVI4M2e protein and 100 μg of Sef4M2e protein were given.

圖5不同部位腸液特異性IgA抗體ELISA結(jié)果
Fig.5ELISAresultsofintestinalfluid-specificIgAindifferentsegmentedintestines

3 討論

本研究設(shè)計(jì)的目的蛋白理論相對(duì)分子質(zhì)量為 46 160，但其在SDS-PAGE圖中顯示的條帶位于55 000～70 000。有研究表明，攜帶His-Tag的融合蛋白在電泳過程中由于空間位阻效應(yīng)導(dǎo)致觀察到的相對(duì)分子質(zhì)量大于其理論值[12]。本研究所表達(dá)的融合蛋白兩端均含有His-Tag，這可能是造成觀察值與理論值偏差較大的原因。

圖1結(jié)果顯示，目的蛋白在未進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)有少量表達(dá)，隨著誘導(dǎo)劑IPTG的加入和誘導(dǎo)條件的優(yōu)化，其表達(dá)量上升，表明構(gòu)建的重組質(zhì)粒中CTA1DD-AVI4M2e蛋白出現(xiàn)了泄漏表達(dá)。蛋白免疫印跡鑒定結(jié)果中，第2泳道未誘導(dǎo)樣品出現(xiàn)免疫印跡，進(jìn)一步證實(shí)CTA1DD-AVI4M2e出現(xiàn)了泄漏表達(dá)。

Lane 1: pre-stained protein marker; Lane 2: GST188-M2e1; Lane 3: GST188-M2e2; Lane 4: GST188-M2e3; Lane 5: GST188-M2e4; Lane 6: GST188.

圖6M2e蛋白免疫印跡檢測(cè)結(jié)果
Fig.6WesternblottingresultsofM2e

A: Specific test of M2e peptides; B: Specific test of Sef4M2e.

圖7M2eELISA檢測(cè)結(jié)果
Fig.7ELISAresultsofM2e

pXXGST-1與pXXGST-2為一組熱誘導(dǎo)蛋白載體，pXXGST-2質(zhì)粒在42 ℃誘導(dǎo)條件下表達(dá)截短的GST188多肽，pXXGST-1為截短的GST188融合表達(dá)載體，適合融合短肽的表達(dá)。將4個(gè)M2e構(gòu)建在pXXGST-1質(zhì)粒C端，可分別誘導(dǎo)表達(dá)GST188-M2e1、GST188-M2e2、GST188-M2e3和GST188-M2e4[13]。融合蛋白CTA1DD-AVI4M2e誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性IgA抗體能特異性識(shí)別4個(gè)單獨(dú)的M2e，也能與串聯(lián)的4M2e發(fā)生抗原抗體反應(yīng)。初步判斷CTA1DD-AVI4M2e引起了腸黏膜免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生了針對(duì)4M2e的特異性IgA抗體。

本研究通過灌服CTA1DD-AVI4M2e融合蛋白誘導(dǎo)腸黏膜產(chǎn)生特異性IgA抗體，發(fā)現(xiàn)抗體效價(jià)在腸道中呈現(xiàn)中間段最低、上段較高和下段最高的特點(diǎn)。吳斌等[14]使用口服微膠囊疫苗免疫羅非魚，發(fā)現(xiàn)魚腸道中IgA抗體效價(jià)自上而下逐漸升高。本研究結(jié)果與其有一定相似性，提示未來(lái)可嘗試進(jìn)行肛門給藥方式進(jìn)行免疫。在繼續(xù)探索口服免疫方式上，如何避免或減少消化道蛋白酶的消化是應(yīng)關(guān)注的重點(diǎn)。本研究雖然利用明膠對(duì)重組蛋白做了保護(hù)，但還可對(duì)保護(hù)劑進(jìn)一步探索。例如，利用新型無(wú)毒材料如殼聚糖、海藻酸鈉等將蛋白包裹起來(lái)制成微膠囊[15-16]，口服之后能很大程度減少降解，到達(dá)受體部位后及時(shí)釋放有效蛋白。乳酸菌是一種腸道益生菌，長(zhǎng)期存在于腸道中，可利用其作為生物載體來(lái)運(yùn)送疫苗。將表達(dá)重組疫苗的基因和特定啟動(dòng)子克隆至乳酸菌中，經(jīng)口服到達(dá)腸道，在適宜條件下誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白疫苗，使其精確定位于腸黏膜表面誘導(dǎo)黏膜免疫反應(yīng)[17]。

禽流感病毒疫苗通過口服免疫、舌下免疫和皮膚注射免疫等均可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生黏膜免疫反應(yīng)[18-19]。本研究最終構(gòu)建的重組蛋白CTA1DD-AVI4M2e具有黏膜免疫和體液免疫效果，產(chǎn)生特異性IgA和IgG抗體，但是否能起到廣譜性抗禽流感病毒作用還需進(jìn)一步的病毒攻擊動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)加以驗(yàn)證。