沈兆瑞

(天津市武清區(qū)楊村第一中學(xué) 301700)

1 質(zhì)疑辨惑

例題： 2011年11月，武漢大學(xué)的科學(xué)家將人的血清白蛋白基因?qū)胨倔w內(nèi)合成了人的血清白蛋白，這種蛋白質(zhì)的生理活性和人體自然產(chǎn)生的這類物質(zhì)是完全一致的。結(jié)合圖1回答轉(zhuǎn)基因水稻培育過(guò)程的相關(guān)問(wèn)題。

其中限制酶MunI的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)是—C↓TTAAG—，而限制酶EcoR I的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)為—G↓AATTC—。為保證重組質(zhì)粒表達(dá)載體的準(zhǔn)確構(gòu)建，應(yīng)用 切割質(zhì)粒，用 切割含目的基因的DNA分子，構(gòu)成重組質(zhì)粒。(參考答案：MunI、EcoR I)

圖1 轉(zhuǎn)基因水稻培育過(guò)程示意圖

該例題的考點(diǎn)在于基因工程中對(duì)限制酶的選擇。其中選擇MunI切割質(zhì)粒毫無(wú)異議，但是，對(duì)于限制酶EcoR I的選擇則眾說(shuō)紛紜。爭(zhēng)議之處在于： 限制酶EcoR I的識(shí)別序列為—GAATTC—，而不是—CTTAAG—。按照EcoR I的識(shí)別序列，那它能否識(shí)別題中的序列呢？

2 條分縷析

2.1 DNA的結(jié)構(gòu)決定其方向 1953年，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)被提出，兩條脫氧核苷酸鏈反向平行構(gòu)成穩(wěn)定的螺旋結(jié)構(gòu)[1]，這暗示著DNA的兩條單鏈必然具有不同的“方向”。相鄰兩個(gè)脫氧核糖以磷酸二酯鍵依次相連，共同構(gòu)成DNA分子的外側(cè)骨架。其中，單條脫氧核苷酸鏈擁有兩個(gè)不同的末端： 5′端(游離的磷酸基團(tuán))和3′端(游離的羥基)。繪圖時(shí)常用5′和3′對(duì)其進(jìn)行標(biāo)注。其次，5′端與3′端的結(jié)構(gòu)差異導(dǎo)致其生物學(xué)功能的不同。例如，DNA聚合酶僅能將游離的脫氧核苷酸聚合到子鏈的3′端，而非5′端。因此，兩條子鏈的延伸(合成)方向均為5′→3′，但合成方式卻不同。其中前導(dǎo)鏈采用連續(xù)復(fù)制的方式，而后隨鏈的合成為不連續(xù)復(fù)制——先通過(guò)合成多條岡崎片段，再形成完整子鏈[2]。

除此之外，高中階段所涉及到的PCR技術(shù)、轉(zhuǎn)錄以及限制酶識(shí)別等過(guò)程均與DNA方向密切相關(guān)。DNA方向性的重要性不言而喻，同樣的堿基排列順序，一旦變換讀取方向則會(huì)呈現(xiàn)截然不同的信息。例如，5′—GAATTC—3′和5′—CTTAAG—3′呈現(xiàn)出完全不同的識(shí)別信息，前者是EcoR I的識(shí)別序列，而識(shí)別后者的為AflII。因而，書(shū)寫(xiě)單條核苷酸鏈有著約定俗成的規(guī)矩——一律按照5′→3′書(shū)寫(xiě)，以免出現(xiàn)讀取“方向”不同的誤解。例如，在PCR擴(kuò)增目的基因的過(guò)程中，常需要設(shè)計(jì)引物。在書(shū)寫(xiě)這一對(duì)反向引物的序列時(shí)，必須都遵循5′→3′的原則。

2.2 繪圖中的DNA也不能忽略方向性問(wèn)題 相同的堿基排列順序，在閱讀方向不同的情況下，則需要不同的限制酶進(jìn)行識(shí)別和切割(表1)。因此，遵循固定的繪制方向就顯得至關(guān)重要，特別是在高中階段(通常不對(duì)DNA的方向進(jìn)行標(biāo)注)。與固定的書(shū)寫(xiě)規(guī)則類似，繪圖中的DNA也不能忽略方向性問(wèn)題。

經(jīng)查閱《基因Ⅷ》《現(xiàn)代分子生物學(xué)》等高等教材，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)有關(guān)DNA 分子的插圖在繪制過(guò)程中都進(jìn)行了方向的標(biāo)注，5′端多位于左上角。尤其在繪制限制酶識(shí)別位點(diǎn)時(shí)，無(wú)論標(biāo)注與否，左上角均為5′端，無(wú)一例外。例如，以DNA為模板轉(zhuǎn)錄RNA過(guò)程中RNA聚合酶的移動(dòng)方向圖(圖2)，不僅直觀地體現(xiàn)出5′→3′的轉(zhuǎn)錄方向，而且更經(jīng)得起推敲。如圖2所示，RNA聚合酶從左向右移動(dòng)，啟動(dòng)子(RNA聚合酶的識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn))位于左側(cè)，即基因首端(上游區(qū)域)。這對(duì)于后續(xù)知識(shí)的學(xué)習(xí)能起到正遷移作用。反之，則不然。

表1 部分限制酶及識(shí)別序列[3]

圖2 以DNA為模板轉(zhuǎn)錄RNA

綜上所述，從上述例題出題者的角度來(lái)看，假設(shè)考慮圖中DNA雙鏈的左上角是3′端，則EcoR I識(shí)別該序列(3′—CTTAAG—5′)貌似也無(wú)可厚非。但為避免產(chǎn)生不必要的誤解，應(yīng)對(duì)例題做相應(yīng)修改，使之遵循左上角為5′端的繪圖規(guī)則。