楊玉有，張丹妍，楊智曦，李新生，呂 靜，馬明福，李練兵*

（國家衛(wèi)生計(jì)生委出生缺陷與生殖健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/重慶市人口和計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究院/重慶市正鼎司法鑒定所，重慶 400020）

短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeats，STR）是一類廣泛存在于人類基因組中具有遺傳多態(tài)性的DNA序列。STR基因座于20世紀(jì)90年代初期首次被作為一種重要的遺傳標(biāo)記應(yīng)用于人類親權(quán)鑒定。目前，STR已經(jīng)成為親權(quán)鑒定中應(yīng)用最廣泛的遺傳標(biāo)記。受誘變劑、放射線等許多因素影響，STR基因座可能會(huì)發(fā)生突變，導(dǎo)致親子鑒定中親代與子代的遺傳標(biāo)記不符合遺傳規(guī)律，從而可能影響親子鑒定結(jié)果的正確性。因此在親子鑒定中，應(yīng)調(diào)查各基因座的突變率，選取那些突變率低的遺傳標(biāo)記。

D18S51基因座是位于18號(hào)染色體長(zhǎng)臂的簡(jiǎn)單四核苷酸重復(fù)序列，早期的STR擴(kuò)增分型系統(tǒng)如英國法庭科學(xué)服務(wù)部建立的第二代復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)[1]和美國聯(lián)邦調(diào)查局發(fā)起建立的DNA聯(lián)合索引系統(tǒng)（Combined DNA Index System，CODIS）[2]均包含了該基因座。當(dāng)下國內(nèi)法醫(yī)DNA分型常用的Identifiler?試劑盒和Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)20A試劑盒等也均包含了該基因座。本文作者通過上述兩個(gè)試劑盒在親子鑒定檢測(cè)工作中的應(yīng)用，對(duì)STR基因座D18S51的突變現(xiàn)象進(jìn)行了觀察與分析，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本

1030例親子鑒定案件樣品來源于重慶市正鼎司法鑒定所檢案。檢驗(yàn)材料包括血樣、帶毛囊毛發(fā)等。

1.1.2 試劑與儀器

Identifiler?試劑盒、Veriti? Thermal Cycler PCR擴(kuò)增儀和3130 Genetic Analyzer購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（Applied Biosystems，Inc.，ABI），Goldeneye? DNA身份鑒定系統(tǒng)20A試劑盒購自基點(diǎn)認(rèn)知技術(shù)（北京）有限公司，STRtyper-10G試劑盒購自珠?？频巧锕こ逃邢薰荆珹GCU 21+1 STR 熒光檢測(cè)試劑盒購自無錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取

采用Chelex-100法提取樣本基因組DNA。

1.2.2 PCR擴(kuò)增和電泳分型

三聯(lián)體親子鑒定采用Goldeneye? 20A試劑盒檢測(cè)，二聯(lián)體親子鑒定聯(lián)合采用Identifiler?試劑盒和STRtyper-10G試劑盒聯(lián)合檢測(cè)。如果出現(xiàn)可疑突變，則補(bǔ)充檢測(cè)AGCU 21+1 STR系統(tǒng)。擴(kuò)增產(chǎn)物通過3130 Genetic Analyzer進(jìn)行毛細(xì)管電泳，GeneMapper ID v3.2軟件進(jìn)行基因型分型。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析

親權(quán)指數(shù)（paternity index，PI）、累計(jì)親權(quán)指數(shù)（cumulative paternity index，CPI）的計(jì)算按文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行[3-4]。計(jì)算所使用的相關(guān)等位基因分布頻率數(shù)據(jù)來自文獻(xiàn)[5]及試劑盒生產(chǎn)廠家所提供的頻率表。如果觀察到等位基因發(fā)生突變，則參考美國血庫協(xié)會(huì)（American Association of Blood Banks，AABB）和國際法醫(yī)遺傳學(xué)會(huì)（International Society for Forensic Genetics，ISFG）推薦的Brenner逐步突變模型計(jì)算PI值[3-4]；STR基因座突變率μ值見參考文獻(xiàn)[6]。

1.2.4 判定依據(jù)

判定親生關(guān)系的理論依據(jù)是孟德爾遺傳定律和行業(yè)規(guī)范[7]及專家共識(shí)[8]。經(jīng)過累計(jì)非父排除概率（cumulative probability of exclusion，CPE）≥99.99%的遺傳標(biāo)記系統(tǒng)的檢測(cè)，經(jīng)過計(jì)算，被檢測(cè)男子的CPI小于0.0001時(shí)，排除被檢測(cè)男子是孩子的生物學(xué)父親；被檢測(cè)男子的CPI大于10000時(shí)，支持被檢測(cè)男子是孩子的生物學(xué)父親[7]。在支持親權(quán)關(guān)系的鑒定中，出現(xiàn)不符合遺傳規(guī)律的分型結(jié)果則考慮發(fā)生突變，增加檢測(cè)AGCU21+1STR試劑盒確證。在三聯(lián)體親權(quán)鑒定中，當(dāng)考慮發(fā)生了突變時(shí)，子代新等位基因的來源根據(jù)子代新等位基因與親代等位基因的差異大小來確定，親代等位基因與子代新等位基因差異最小的一方定為突變來源方。

2 結(jié) 果

對(duì)存在可疑突變的案例，增加檢測(cè)AGCU 21+1系統(tǒng)，均未發(fā)現(xiàn)新的不符合遺傳規(guī)律的分型結(jié)果。

1030例鑒定中有856例鑒定認(rèn)定親子關(guān)系，CPI均＞10 000；其中二聯(lián)體鑒定590例、三聯(lián)體鑒定266例，減數(shù)分裂觀察次數(shù)為1122；共發(fā)現(xiàn)突變30例，其中D18S51基因座突變8例，突變率為0.7130%。

8例突變案例中突變來源均為父方，均為一步突變，其中5例表現(xiàn)為重復(fù)單位的減少，2例表現(xiàn)為重復(fù)單位的增加，另外1例尚不能確定突變的等位基因及重復(fù)單位的增減。8例發(fā)生突變的等位基因的重復(fù)單位重復(fù)次數(shù)均在14次以上，均發(fā)生于堿基結(jié)構(gòu)均一即重復(fù)次數(shù)為整數(shù)而不伴有不完全重復(fù)單位插入的等位基因，結(jié)果見表1。

表1 8例D18S51基因座突變的親權(quán)鑒定案例分析（n）

3 討 論

3.1 突變模式與突變步數(shù)

現(xiàn)有研究表明，STR基因座突變主要由復(fù)制滑動(dòng)造成，該類突變符合逐步突變模式，一步突變大約占突變的90%[8]。本研究所發(fā)現(xiàn)的8例突變均為一步突變，未發(fā)現(xiàn)多步突變。

3.2 突變來源者民族

依據(jù)AABB 2008年度數(shù)據(jù)分析，民族也是STR基因座突變率差異的原因之一[9]，所以本調(diào)查標(biāo)明了突變來源者的來源地區(qū)及民族以便于與其他地區(qū)及民族比較。

3.3 突變的來源

由于精子細(xì)胞分化經(jīng)歷的細(xì)胞分裂次數(shù)比卵細(xì)胞多等原因，父源突變多于母源突變。本研究發(fā)現(xiàn)的8例突變均為父源突變。劉素娟等[10]對(duì)中國南方漢族10 000例肯定親子關(guān)系的三聯(lián)體親權(quán)鑒定案例進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)父源突變率與母源突變率的平均比值約為3.57：1，與Brenner[11]推薦的平均比值3.5較為接近。但AABB 2008年度的數(shù)據(jù)[9]也顯示這一比值在不同的基因座差異較大，最小為1.25倍，最大則達(dá)到18.466倍。

3.4 突變的基因座與突變率

STR基因座的突變率與等位基因中基序的堿基結(jié)構(gòu)和重復(fù)次數(shù)有關(guān)[8]。AABB 2008年[9]的統(tǒng)計(jì)結(jié)果及李成濤等[12]對(duì)中國多地區(qū)人群數(shù)據(jù)的大樣本統(tǒng)計(jì)中，D18S51均是所統(tǒng)計(jì)基因座中突變率第三高的基因座，平均突變率分別為0.1808%和0.1666%；嚴(yán)江偉等[6]報(bào)道的D18S51基因座平均突變率為0.060%；在劉素娟等[10]的統(tǒng)計(jì)結(jié)果中，D18S51則是突變率最高的基因座，平均突變率為0.23%。本調(diào)查所得到的D18S51突變率為0.7130%，高于上述文獻(xiàn)報(bào)道，可能與本次調(diào)查觀察的減數(shù)分裂次數(shù)有限有關(guān)，也可能與地區(qū)、種群差異有關(guān)。

3.5 突變的應(yīng)對(duì)

李成濤等[12]研究表明，約100例單親親子鑒定或50例三聯(lián)體親子鑒定就可能遇上1～2例突變。因此，突變是親子鑒定檢案中一個(gè)不可回避的問題。

當(dāng)檢測(cè)一定數(shù)量的STR基因座只有少數(shù)幾個(gè)基因座不符合遺傳規(guī)律時(shí)，應(yīng)考慮突變的可能性。遇到此類情況后，建議首先用不同的試劑重復(fù)檢測(cè)，保證分型正確。然后計(jì)算疑似突變位點(diǎn)的PI值，計(jì)算突變率時(shí)建議盡可能采取本地區(qū)同種族人群大樣本調(diào)查所得的參數(shù)，在母源數(shù)據(jù)不充分的情況下，母源突變率可直接取值0.0005[7]。經(jīng)過計(jì)算CPI，當(dāng)CPI大于0.0001而小于10000時(shí)，應(yīng)通過增加檢測(cè)遺傳標(biāo)記來達(dá)到要求[7]；當(dāng)CPI大于10000時(shí)，應(yīng)慎重考慮，仍建議增加檢測(cè)新的遺傳標(biāo)記：如果不存在親權(quán)關(guān)系，則會(huì)發(fā)現(xiàn)更多的不符合遺傳規(guī)律的基因座。

為了更全面地了解中國人群中親權(quán)鑒定常用STR基因座的突變規(guī)律，建議各地區(qū)學(xué)者加強(qiáng)對(duì)突變現(xiàn)象的觀察與報(bào)道，分析突變來源和類型，了解突變來源者的民族和年齡等更多、更加全面的信息，以實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)共享和比較分析。