由淑萍 任立松 馬 龍 賀 筍陳澤良王 嶸 劉 濤*

（1．新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；2．新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司，新疆 烏 魯木齊 830032；3．中國解放軍69337部隊，新疆 額 敏 834601；4．新疆醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院，新疆 烏 魯木齊 830011）

自Franklin[1]首次分離并報道以來，阪崎腸桿菌(Cronobacter sakazakii)已經(jīng)多次引起重大食品安全事件，造成嚴(yán)重的后果[2-3]。2007年新疆地區(qū)在進(jìn)出口食品中檢測并分離到阪崎腸桿菌[4]。課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)阪崎腸桿菌新疆分離株經(jīng)酪蛋白氨基酸酵母浸膏培養(yǎng)液(casamino acid yeast extract medium，CAYE)培養(yǎng)后，其純化上清蛋白在一定條件下能夠?qū)θ槭蟾鹘M織器官產(chǎn)生損傷，尤其對肝組織損傷較為嚴(yán)重[5-7]，為進(jìn)一步探索該上清蛋白損傷肝組織的分子機(jī)制，本課題組純化阪崎腸桿菌培養(yǎng)上清蛋白，將上清蛋白加入HepG2肝細(xì)胞培養(yǎng)液中，8 h后收集細(xì)胞并采用高通量測序法對實(shí)驗(yàn)組及對照組細(xì)胞基因進(jìn)行檢測，分析不同組中基因的差異表達(dá)、轉(zhuǎn)錄本水平定量分析、GO功能富集分析、KEGG通路富集分析，并對RPS18、RFC4基因進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株與細(xì)胞

阪崎腸桿菌新疆分離株IQCC10418，由中國檢驗(yàn)科學(xué)院趙貴明老師惠贈，HepG2細(xì)胞購于武漢普諾賽生物公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

CO2培養(yǎng)箱購于Thermo公司；核酸分析儀購于Biochrom公司；CAYE培養(yǎng)液購于北京陸橋公司，配制按照Quintero-villegas等[8]提供的方法進(jìn)行，胎牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)6孔板購于Gibco公司，Trizol試劑購于Qiagen公司，實(shí)時熒光定量儀Light Cycler 2.0購于美國Roche羅氏公司，BCA蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒購于Sangon Biotech公司。

1.3 方法

1.3.1 阪崎腸桿菌培養(yǎng)液上清蛋白純化 采用CAYE培養(yǎng)基于CO2培養(yǎng)箱中37 ℃條件下培養(yǎng)阪崎腸桿菌；12 000 g、4 ℃離心CAYE培養(yǎng)液5 min；0.45 μm膜過濾上清，根據(jù)濾過后上清液的體積，按照1∶1比例加入飽合硫酸銨液并攪拌30 m in；12 0 00 g 、4 ℃ 再次進(jìn)行離心，取沉淀；磷酸鹽緩沖液(pH=7.0)懸浮，4 ℃ 透析。

1.3.2 蛋白質(zhì)濃度測定 BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒檢測純化產(chǎn)物中蛋白質(zhì)濃度，用蒸餾水稀釋為含蛋白濃度為1.6 μg/mL的水溶液。

1.3.3 感染HepG2肝細(xì)胞、提取總RNA 含10%胎牛血清的DMEM(高糖)完全培養(yǎng)液培養(yǎng)HepG2細(xì)胞至長滿培養(yǎng)瓶，細(xì)胞呈單層致密狀時，常規(guī)胰蛋白酶消化傳代，24 h換液，72 h再傳代；實(shí)驗(yàn)調(diào)整HepG2細(xì)胞濃度至1×106/mL，于6孔培養(yǎng)板中分別加入1 000 μL蒸餾水及1 000 μL純化產(chǎn)物稀釋液(終濃度為1.6 μg/mL)，建立對照組與實(shí)驗(yàn)組，每組3個復(fù)孔，8 h后，加胰酶回收；采用Trizol試劑盒提取總RNA；瓊脂糖凝膠電泳分析樣品RNA完整性及是否存在DNA污染；并檢測RNA純度[D(260)/D (280)比值]。

1.3.4 cDNA文庫構(gòu)建及高通量測序 用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物合成第一鏈cDNA，用DNA聚合酶合成第二鏈cDNA，送Novogene公司illumina芯片測序平臺進(jìn)行高通量測序，采用GoMiner數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Gene Ontology(GO)富集分析，采用KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Pathway分 析。

1.3.5 差異表達(dá)基因分析 采用DESeq2軟件統(tǒng)計比較實(shí)驗(yàn)組和對照組的cDNA文庫，RNA-seq測序技術(shù)進(jìn)行差異顯著性分析，本實(shí)驗(yàn)中兩組間轉(zhuǎn)錄本的log2(Fold Change)絕對值大于1作為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.6 實(shí)時熒光定量PCR 由于高通量測試結(jié)果信息量巨大，只能提供初步篩選結(jié)果，不能十分準(zhǔn)確分析單個基因的狀態(tài)及表達(dá)情況。因此進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)驗(yàn)證十分必要。本次我們將選取log2(Fold Change)值為-1.10 且與核糖體密切相關(guān)、調(diào)節(jié)因子發(fā)揮重要作用的RPS18基因(ribosomal protein S18)和log2(Fold Change)值為2.13且與調(diào)控DNA復(fù)制與修復(fù)的功能分子RFC (replication factor C)亞基4進(jìn)行驗(yàn)證。β-actin為內(nèi)參基因。RPS18基因(引物序列5′-3′)：P1，tggatcactcggataaatgcggtaact；P2， tggatcactcggataaatgcggtaact(GenBank登 錄 號AY75781.1)。 RFC4基 因 ： P1， ggaactggaaaaacatcca ctattttg； P2， ctgagcagctgaggtcatagaatctgc(GenBank登 錄號CR536561.1)。反應(yīng)體系共20 μL，Platinum?SYBR?Green qPCR SuperMix-UDG 10 μL，上游引物(10 μmol/L)0.4 μL，下游引物(10 μmol/L) 0.4 μL，模板 2 μL，純水7.2 μL。反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃、15 s，95 ℃、10 s，55℃、10 s，50個循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1 總RNA提取結(jié)果

瓊脂糖電泳結(jié)果表明，提取的RNA無DNA污染。經(jīng)檢測各組的D(260)/D(280)的值均在1.8～2.0之間，表明提取的總RNA純度符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.2 差異表達(dá)基因

經(jīng)高通量測序及基因差異表達(dá)結(jié)果分析表明，與對照組比較，共有5 120個差異表達(dá)基因，其中2 155個上調(diào)，2 965個下調(diào)。長鏈非編碼RNA(lncRNA)為226個，占差異表達(dá)基因總數(shù)的4.41%，說明差異表達(dá)基因中非編碼序列較少。表1為前5位表達(dá)上調(diào)的基因，表2為前5位表達(dá)下調(diào)的基因。

表1 前5位表達(dá)上調(diào)的基因

表2 前5位表達(dá)下調(diào)的基因

2.3 差異表達(dá)基因涉及到的信號通路

GO和KEGG pathway分析表明，經(jīng)上清蛋白作用后，基因差異表達(dá)涉及到219個信號通路，GO富集分析顯示，差異基因主要參與核分裂、有絲分裂、復(fù)制等多個生物學(xué)過程(見圖1)。Pathway分析顯示，具有顯著富集的信號通路有5個，差異基因主要參與DNA的復(fù)制、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、精氨酸和脯氨酸代謝等(見表3)。

圖1 GO富集分析結(jié)果

表3 基因差異表達(dá)參與的信號通路

2.4 qPCR驗(yàn)證結(jié)果

qPCR結(jié)果見圖2和圖3，可見選取的RPS18、RFC4 mRNA檢測結(jié)果與高通量測序的結(jié)果相同。與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組RPS18 mRNA表達(dá)呈現(xiàn)明顯下降趨勢，RFC4 mRNA表達(dá)則顯著上升，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

目前，國內(nèi)外對于阪崎腸桿菌的污染途徑、致病因子、致病機(jī)理等報道非常有限。2003年，Pagotto[9]首次描述了某種類腸毒素化合物可能是阪崎腸桿菌產(chǎn)生的一種毒力因子。阪崎腸桿菌在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的腸毒素是其致病的重要因素，侵入腦微血管上皮細(xì)胞后，其外膜蛋白A和外膜蛋白X能夠穿過血腦屏障，并存在于腦巨噬細(xì)胞中影響細(xì)胞因子的分泌，導(dǎo)致嚴(yán)重的大腦疾病，如新生兒腦膜炎、腦梗塞、腦囊腫等，是阪崎腸桿菌的重要致病因子[10-13]。本研究室在對阪崎腸桿菌新疆株的研究過程中發(fā)現(xiàn)，編號為IQCC 10418號菌株在經(jīng)CAYE培養(yǎng)后，其培養(yǎng)上清中產(chǎn)生某種活性蛋白[14]能夠?qū)C(jī)體產(chǎn)生損傷，推測可能與阪崎腸桿菌致病有關(guān)。

圖2 兩組HepG2細(xì)胞中RPS18 mRNA檢測結(jié)果分析

圖3 兩組HepG2細(xì)胞中RFC4 mRNA檢測結(jié)果分析

本研究發(fā)現(xiàn)阪崎腸桿菌培養(yǎng)上清蛋白侵襲HepG2肝細(xì)胞，通過提取總RNA、反轉(zhuǎn)錄、高通量測序，異常表達(dá)基因有5 120個，包括2 155個表達(dá)上調(diào)基因，2 965個表達(dá)下調(diào)基因。CA9基因表達(dá)量較高，CA9基因編碼碳酸酐酶蛋白，是鋅金屬酶家族中一員，與機(jī)體的鈣代謝、酸平衡等有關(guān)；差異表達(dá)下調(diào)明顯的ACP1基因，編碼Acid phosphatase 1蛋白，該蛋白屬于磷酸酪氨酸蛋白家族成員之一，與酪氨酸代謝相關(guān)。還有部分差異表達(dá)基因如CALR基因、TMEM 基因等編碼的蛋白涉及細(xì)胞的一些重要功能，如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、鈣代謝等功能[15]。

在差異基因的GO富集和pathway分析[16-18]中還發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因參與了219個信號通路，阪崎腸桿菌侵襲HepG2肝細(xì)胞后，其差異基因的表達(dá)多為染色體、著絲粒、核糖體等變化，核糖體可從轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個水平上調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)，從而調(diào)控微生物的次級代謝，同時，核糖體結(jié)構(gòu)改變，其代謝產(chǎn)物合成的調(diào)控系統(tǒng)也會出現(xiàn)變化，誘導(dǎo)真核細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化及有絲分裂[19-20]；在差異表達(dá)基因的信號通路中，同樣涉及DNA的復(fù)制、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、精氨酸和脯氨酸代謝等多種通路，其中參與差異表達(dá)基因最多為Ribosome(hsa03010)，與蛋白的翻譯、轉(zhuǎn)運(yùn)等功能相關(guān)，參與DNA的修復(fù)，調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡和分化。

進(jìn)一步進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證表明，RPS18是由RPS18基因編碼的一種蛋白，參與組成核糖體的40S小亞基，通過與起始因子以及其他核糖體蛋白相互作用，在翻譯起始過程中作為一種調(diào)節(jié)因子發(fā)揮重要的作用。此外，RPS18核糖體蛋白是一種公認(rèn)的Ca2+/鈣調(diào)蛋白激活的蛋白激酶II底物。研究表明，RPS18參與了阪崎腸桿菌培養(yǎng)上清蛋白引起的HepG2肝細(xì)胞的病變，能夠調(diào)節(jié)HepG2肝細(xì)胞的毒力和致病力，參與了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。復(fù)制因子C(replication Factor C，RFC)是與DNA復(fù)制和修復(fù)過程密切相關(guān)的蛋白，RFC在ATP存在的情況下，能將PCNA和DNA聚合酶δ裝配到附有引物的模板上，從而有效的延伸DNA復(fù)制鏈；而RFC4基因?qū)笵NA復(fù)制損傷修復(fù)能力具有重要的調(diào)控作用，如RFC4等基因下調(diào)可減緩肝癌細(xì)胞的增殖[21]。研究表明，RFC4基因上調(diào)，參與了DNA復(fù)制的過程，導(dǎo)致了阪崎腸桿菌培養(yǎng)上清蛋白引起的HepG2肝細(xì)胞病變的發(fā)生。

綜上，從阪崎腸桿菌培養(yǎng)上清中分離純化的蛋白質(zhì)，可產(chǎn)生HepG2肝細(xì)胞病變，推測該蛋白質(zhì)的生物活性可能與RPS18、RFC4基因等差異表達(dá)，引起的核糖體、染色體、著絲粒等的變化相關(guān)，參與DNA的復(fù)制與修復(fù)、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、精氨酸和脯氨酸代謝等多條信號通路。