王 晗倪 娟 周 滔 楊國(guó)防 汪 旭*

( 1．云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆 明 650500；2．云南師范大學(xué)生物能源持續(xù)開(kāi)發(fā)與利用教育部工程研究中心，云南 昆 明 650500；3．上海三譽(yù)華夏基因科技有限公司，上海 201100 )

納米顆粒(nanoparticles，NPs)，是指直徑小于100 nm的微粒。納米級(jí)的顆粒較正常顆粒(fine particle)而言，具有不同的理化特征，如表面積與體積比增大，活性位點(diǎn)、電荷和形狀改變，表面衍生性增加，光催化活性增強(qiáng)，熱性能更為優(yōu)越等。目前，NPs已廣泛運(yùn)用到電子工業(yè)、食品產(chǎn)業(yè)、建筑材料、紡織品、醫(yī)療器械和藥物、個(gè)人護(hù)理用品如防曬霜等領(lǐng)域[1]。隨著人類越來(lái)越多的暴露在含NPs的用品中，NPs對(duì)人的健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估已成為研究熱點(diǎn)[2]。研究已證實(shí)，NPs對(duì)人類健康存在威脅，納米氧化鋅、二氧化鈦、氧化銅、碳納米管、碳富勒烯等進(jìn)入機(jī)體后，可引起重要器官病理性損傷幾率增加，甚至誘發(fā)癌癥[3-4]。物理化學(xué)特性如顆粒晶體結(jié)構(gòu)、尺寸、化學(xué)組成等都可影響NPs毒性，其中，顆粒尺寸是NPs較正常顆粒毒性更大的主要因素，較小的尺寸更易進(jìn)入并累積到機(jī)體深層，影響器官及細(xì)胞正?；顒?dòng)，顆粒尺寸減小將引起顆粒表面積增大，同時(shí)也增加了活細(xì)胞中的化學(xué)反應(yīng)性和顆粒的可穿透性[5-6]。

NPs以吸入(inhalation)、皮膚滲透(dermal penetration)和口服攝入(ingestion)三種最為常見(jiàn)的途徑進(jìn)入人體，隨食物或空氣吞入的NPs主要在小腸被吸收并進(jìn)入血液，吸入的NPs聚集到肺，然后進(jìn)入肺毛細(xì)血管[7-8]。之后，NPs通過(guò)血液循環(huán)分布并積累到全身各個(gè)器官，甚至通過(guò)血腦屏障、胎盤(pán)屏障等，其中，肝臟是NPs體內(nèi)積累的最主要靶器官[9]。肝臟對(duì)人類健康有重要維護(hù)作用，是人體最主要的代謝及解毒器官，但是，NPs積累到肝臟后，可引起肝細(xì)胞毒性、脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、慢性炎癥等，而慢性肝臟炎癥的持續(xù)進(jìn)展和惡性轉(zhuǎn)化可以導(dǎo)致肝癌發(fā)生。因此，NPs對(duì)肝細(xì)胞及肝臟的損傷及毒性研究成為評(píng)價(jià)納米顆粒安全性的重點(diǎn)。

1 納米顆粒對(duì)肝臟毒性效應(yīng)

使用最為廣泛的顆粒如納米銀、納米二氧化鈦、納米氧化銅等是近年來(lái)研究NPs對(duì)肝臟毒性效應(yīng)的重點(diǎn)，已有大量研究證實(shí)，這些顆粒能產(chǎn)生明顯肝臟毒性，引起肝酶升高、肝臟炎癥以及肝組織壞死等。

1.1 誘發(fā)肝臟炎癥

NPs誘發(fā)肝臟炎癥可能與促炎因子表達(dá)升高相關(guān)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雄性Wistar大鼠以氣管滴注的方法每周兩次暴露于0.24 mg/kg納米氧化鎳中，持續(xù)6周后出現(xiàn)肝臟炎癥，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，納米氧化鎳明顯增加了肝臟中促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-6的濃度，但降低了抗炎細(xì)胞因子IL-4和IL-10的水平[10]。而另一個(gè)研究選用直徑1 nm和8 nm的納米鉑給小鼠進(jìn)行靜脈注射，發(fā)現(xiàn)1 nm的納米鉑在給藥后3和6 h均顯著誘導(dǎo)了IL-1β和IL-6的產(chǎn)生，肝臟出現(xiàn)炎癥，相較而言，8 nm的納米鉑即使在20 mg/kg下也未對(duì)小鼠產(chǎn)生明顯毒性[11]。

含有NPs的材料也同樣可能引起肝臟損傷。Saber等[12]研究證實(shí)，給小鼠氣管滴注含多壁碳納米管的環(huán)氧樹(shù)脂復(fù)合材料機(jī)械磨損產(chǎn)生的粉塵溶液會(huì)引起小鼠肝臟炎癥和壞死等組織病理學(xué)改變，但是暴露在不含多壁碳納米管的環(huán)氧樹(shù)脂粉塵溶液中的小鼠中未觀察到肝臟的損傷。

1.2 引起肝臟損傷

NPs還可引起肝臟損傷。Alarifi等[13]通過(guò)腹膜內(nèi)注射50 nm的納米二氧化鈦后，在小鼠肝臟中觀察到肝臟組織學(xué)變化以及堿性磷酸酶(alkaline phosphates，ALP)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase，GOT)水平的增加，指示肝功能受損嚴(yán)重。用聲輻射力脈沖成像讀取肝臟剪切波速(shear wave velocity，SWV)值并檢測(cè)血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(glutamic pyruvic transaminase，ALT)，發(fā)現(xiàn)吸入二氧化硅納米顆粒能增加SWV和ALT值，誘導(dǎo)大鼠肝損傷[14]。雄性Wistar大鼠通過(guò)每周氣管內(nèi)滴注納米氧化鎳(0.015、0.06和0.24 mg/kg)兩次，結(jié)果顯示，納米氧化鎳暴露后，ALT、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、ALP和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶升高，肝細(xì)胞水腫，肝竇消失，嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，肝臟損傷嚴(yán)重[10]。小鼠暴露于200 mg/kg納米氧化鋅90 d 可造成肝臟損傷，包括局灶性肝細(xì)胞壞死、中央靜脈充血擴(kuò)張、ALT和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平顯著升高[15]。

1.3 改變肝臟結(jié)構(gòu)及功能

NPs還可引起肝臟結(jié)構(gòu)及功能改變。此外，Sun等[16]將斑馬魚(yú)胚胎暴露在50 mg/L的納米氧化銅下4 h后，發(fā)現(xiàn)納米氧化銅可引起肝毒性，同時(shí)斑馬魚(yú)胚胎暴露于高劑量的納米氧化銅中會(huì)導(dǎo)致肝臟發(fā)育不良。Vesterdal等[17]給Zucker大鼠經(jīng)口灌胃6.4 mg/kg 的碳黑后，大鼠肝臟的脂質(zhì)負(fù)荷增加，研究認(rèn)為碳黑暴露與肝脂肪變性有關(guān)。Almansour等[18]將雄性Wistar白化大鼠暴露于納米氧化鋅中(每日暴露劑量為2 mg/kg)，持續(xù)21 d后取大鼠的肝臟活組織進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，他們發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組大鼠相比，暴露于納米氧化鋅的大鼠肝組織中出現(xiàn)竇狀擴(kuò)張、小葉和門靜脈三支血管炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肝組織壞死、水樣變性等。

此外，當(dāng)機(jī)體存在慢性肝病如酒精性肝病、脂肪肝等情況下接觸納米顆粒，更易導(dǎo)致肝臟損傷加劇。有研究用不會(huì)引起正常小鼠肝組織毒性的納米銀濃度處理超重小鼠時(shí)，納米銀易促使小鼠的脂肪肝發(fā)展為脂肪性肝炎，該研究還發(fā)現(xiàn)納米銀會(huì)進(jìn)一步抑制脂肪酸氧化，誘導(dǎo)并增加小鼠肝臟炎癥[19]。Kermanizadeh等[20]將乙醇預(yù)處理小鼠暴露于納米銀后，小鼠的肝臟炎癥和肝臟病變程度惡化，另外，該研究還發(fā)現(xiàn)乙醇影響了肝臟受NPs攻擊后的恢復(fù)能力。

2 納米顆粒毒性效應(yīng)的可能機(jī)制

NPs通過(guò)產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)、誘導(dǎo)DNA損傷、損傷細(xì)胞膜、改變基因組甲基化等毒性機(jī)制，誘導(dǎo)肝臟毒性，對(duì)肝細(xì)胞及肝臟組織產(chǎn)生損傷，最終影響肝臟正常功能，打破機(jī)體健康。其中，研究普遍認(rèn)為，NPs表現(xiàn)出毒性作用的主要機(jī)制是產(chǎn)生過(guò)量ROS，最終誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化損傷，而近年來(lái)研究也發(fā)現(xiàn)，除了產(chǎn)生ROS，NPs也可直接破壞細(xì)胞膜、擾亂基因表達(dá)等引起肝細(xì)胞和組織壞死。

2.1 產(chǎn)生ROS

NPs可通過(guò)三方面誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生。其一，部分NPs表面如納米二氧化硅有促氧化功能團(tuán)，當(dāng)與胞內(nèi)氧化劑結(jié)合后可直接產(chǎn)生ROS；其二，當(dāng)NPs進(jìn)入細(xì)胞的線粒體后，它們會(huì)損傷電子傳遞鏈、引起線粒體膜的去極化，而受損線粒體則會(huì)產(chǎn)生大量ROS；其三，NPs進(jìn)入細(xì)胞中會(huì)激活包括巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞在內(nèi)的免疫細(xì)胞，活化的免疫細(xì)胞則會(huì)增加ROS的產(chǎn)生[21]。由NPs誘導(dǎo)的胞內(nèi)過(guò)量 ROS 生成及其引起的胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)正是導(dǎo)致細(xì)胞、組織損傷甚至細(xì)胞死亡的主要原因之一。其中，ROS可與DNA發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致DNA氧化，DNA鏈斷裂，形成DNA損傷的生物標(biāo)志物即8-氧代-7，8-二氫-2 -脫氧鳥(niǎo)苷 (8-oxo-7，8-dihydro-2 -deoxyguanosine) ，并誘導(dǎo)微核形成，產(chǎn)生明顯遺傳毒性[22]，也可與脂質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，形成脂質(zhì)過(guò)氧化物，破壞及損傷生物大分子，影響細(xì)胞功能。

2.2 損傷細(xì)胞膜

NPs可直接(物理?yè)p傷)或間接(氧化損傷)破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及活性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。Salatin等[23]發(fā)現(xiàn)，帶正電荷的NPs能增加與帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜的相互作用，從而增加細(xì)胞吞噬作用，破壞細(xì)胞膜功能。此外，NPs還可通過(guò)產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化來(lái)影響細(xì)胞膜完整性和功能穩(wěn)定[24]。

2.3 形成蛋白質(zhì)電暈

NPs進(jìn)入生物環(huán)境中導(dǎo)致帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)吸附在帶正電荷的顆粒上，形成蛋白質(zhì)電暈(protein corona)。蛋白質(zhì)電暈會(huì)改變NPs的尺寸、聚集狀態(tài)以及表面性質(zhì)，也會(huì)影響細(xì)胞對(duì)NPs的攝取[25]，此外，胞內(nèi)蛋白質(zhì)也因吸附帶電納米顆粒而改變其分子構(gòu)象及折疊，最終失活。研究發(fā)現(xiàn)，吸附在超順磁性納米氧化鐵上時(shí)，轉(zhuǎn)鐵蛋白會(huì)因構(gòu)象修飾而失活[26]。另外，納米二氧化鈦對(duì)磷酸鹽基團(tuán)具有高度親和力，它會(huì)結(jié)合蛋白質(zhì)的磷酸化形式，干擾涉及磷酸化-去磷酸化反應(yīng)的細(xì)胞過(guò)程，比如在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，有研究猜想這可能是納米二氧化鈦損傷如DNA修復(fù)過(guò)程等細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的一種方式[27]。

2.4 改變基因組甲基化狀態(tài)

NPs可通過(guò)改變DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)及活性，影響DNA甲基化水平，從而影響全基因組表觀遺傳修飾，這可能在NPs致癌過(guò)程中起重要作用。Mytych等[28]發(fā)現(xiàn)納米金剛石能促使DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)上調(diào)，引起癌細(xì)胞基因組高甲基化。Bai等[29]研究亦表明，納米二氧化鈦會(huì)增加DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性，從而引起DNA修復(fù)蛋白啟動(dòng)子甲基化異常。

3 減少納米顆粒產(chǎn)生肝臟毒性的策略

基于NPs最主要毒性是產(chǎn)生ROS，近來(lái)，部分研究也著力于找出可有效代謝、控制ROS的抗氧化劑，以對(duì)NPs引起的肝臟毒性起到緩解作用。Niu等[30]發(fā)現(xiàn)，葡萄籽原花青素提取物(grape seed procyanidin extract，GSPE)可以劑量依賴的方式降低暴露在納米二氧化鈦中小鼠細(xì)胞的DNA損傷、ROS生成及丙二醛積累，有效阻止了小鼠暴露于納米二氧化鈦下肝的組織病理學(xué)和生物標(biāo)志物的改變。Azim等[31]發(fā)現(xiàn)口服納米二氧化鈦導(dǎo)致MDA水平升高，小鼠肝臟谷胱甘肽表達(dá)降低，DNA損傷明顯，而在納米二氧化鈦暴露后1個(gè)月，肌鈦和維生素E的組合口服治療，可減弱小鼠肝臟的毒性作用。

Sonane等[32]研究發(fā)現(xiàn)，納米二氧化鈦和氧化鋅可誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS并提高秀麗線蟲(chóng)致死率，但姜黃素和維生素C可在納米顆粒存在的情況下提高線蟲(chóng)生存率，降低ROS的產(chǎn)生。該研究也提出將姜黃素和維生素C并入日常飲食可避免納米毒性，抗氧化劑的膳食補(bǔ)充在對(duì)抗NPs的毒性以及致死性方面非常有效，并可提供機(jī)體抵抗進(jìn)一步暴露的能力。

4 展望

目前，NPs毒性研究已逐漸深入，研究者們?cè)噲D從不同層面來(lái)解析NPs的致毒機(jī)制，以便更好對(duì)各種納米材料進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)。NPs引起的氧化損傷容易導(dǎo)致組織發(fā)生炎癥，而人類及環(huán)境的NPs暴露濃度較低，往往不能在短期出現(xiàn)急性損傷，但容易產(chǎn)生慢性炎癥，因此，NPs對(duì)肝臟毒性的評(píng)估也應(yīng)把長(zhǎng)期低劑量暴露考慮在內(nèi)。此外，檢測(cè)、靶向、治療且不產(chǎn)生副作用的納米腫瘤學(xué)方面的研究也正在興起，NPs由于尺寸小，可進(jìn)入到機(jī)體任何細(xì)胞當(dāng)中，有研究也發(fā)現(xiàn)，納米銀、納米金及納米銀/金混合物可在二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine，DEN)誘導(dǎo)的肝癌中起到保肝活性，它們可特異性殺死肝癌細(xì)胞，對(duì)肝癌有潛在的抗癌活性，但不影響動(dòng)物的體質(zhì)量，因此，研究也認(rèn)為納米銀和納米金可能具備有效納米藥物開(kāi)發(fā)的潛力[33]。這項(xiàng)研究給我們以啟示，如果確定某種NPs可定向損傷某類細(xì)胞群體，將會(huì)極大推進(jìn)腫瘤靶向治療。最后，在日常飲食中使用抗氧化劑作為減緩納米毒性的方法還需進(jìn)行大量研究，以便在目前尚不能對(duì)NPs進(jìn)行準(zhǔn)確的安全性評(píng)價(jià)的情況下，我們可通過(guò)簡(jiǎn)單有效的方法避免NPs引起的慢性炎癥，降低退行性疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。