趙 吉 劉文斌 陳洪強(qiáng)劉晉祎楊惠芳* 曹佳*

（1．寧夏醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，寧夏銀川 750004；2．陸軍軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院毒理學(xué)研究所，重慶 400038）

肝癌是最為常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一。近年肝癌在全世界癌癥的死因中位列第2位，其發(fā)病率和死亡率不斷升高[1]。而對(duì)肝癌的治療手段主要是肝切除和肝移植[2]，以及一些適當(dāng)?shù)乃幬镏委?，但只?%～10%新發(fā)肝癌患者可以進(jìn)行手術(shù)切除，而且術(shù)后具有較高的復(fù)發(fā)率[3]。同時(shí)很多患者都是在晚期才確診，這也是導(dǎo)致肝癌患者生存率較低的因素之一。因此，篩選出可以早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療的生物標(biāo)志物[4]，可以作為降低肝癌的發(fā)生率、死亡率以及改善肝癌病人預(yù)后的重要手段，具有十分重要的科學(xué)和臨床價(jià)值。

在前期的篩選實(shí)驗(yàn)研究中[5]，我們通過(guò)甲基化芯片和表達(dá)譜芯片分析發(fā)現(xiàn)WFDC1(whey acidic protein four-disulfide core domain 1)基因在肝癌組織中有較高的甲基化水平且表達(dá)下調(diào)，因此我們推測(cè)它可能是一個(gè)候選的抑癌基因。WFDC1基因定位于染色體16q24[6]，這是癌癥中雜合性頻繁喪失的一個(gè)區(qū)域，它在前列腺癌[7]、 黑色素瘤[8]、 纖維肉瘤[9]等腫瘤中表達(dá)均明顯下調(diào)。目前還未見有關(guān)WFDC1基因在肝癌組織中的表達(dá)情況及其與患者生存和預(yù)后關(guān)系的文獻(xiàn)報(bào)道。為了分析WFDC1基因在肝癌患者中的表達(dá)情況，探討該基因在肝癌患者中的表達(dá)是否可以作為肝癌早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療的生物標(biāo)志和生存預(yù)后的指標(biāo)，我們采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)檢測(cè)了40例肝癌患者的腫瘤組織和癌旁組織，以及肝癌細(xì)胞株和微囊藻毒素(microcystin-leucine arginine，MCLR)誘導(dǎo)的L02惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞中WFDC1 mRNA的表達(dá)水平，同時(shí)利用腫瘤基因圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)中表達(dá)的數(shù)據(jù)，分析了該基因表達(dá)與臨床病理指標(biāo)以及肝癌患者生存預(yù)后的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和細(xì)胞培養(yǎng)

正常人肝細(xì)胞株L02、肝癌細(xì)胞株SMMC-7721、HepG2、Hep3B、Huh-7，均購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。肝癌細(xì)胞株SMMC-7721、HepG2、Hep3B、Huh-7用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。L02細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基在CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

在L02細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，采用10 μg/L的微囊藻毒素連續(xù)染毒培養(yǎng)至35代，分別在第5、15、25、35代收取細(xì)胞樣品，命名為P5、P15、P25、P35。同時(shí)采用軟瓊脂實(shí)驗(yàn)和裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)對(duì)不同代數(shù)的惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行了惡性程度的檢測(cè)[5]。

1.2 臨床樣本

40例肝癌患者的癌組織和癌旁組織來(lái)源于陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院手術(shù)切除的肝癌患者的組織，距離腫瘤邊緣5 cm以外的組織作為癌旁對(duì)照組，所有肝癌組織和癌旁組織都經(jīng)過(guò)病理驗(yàn)證。取出樣本后立即置于液氮中速凍然后置于-80 ℃冰箱保存。所有樣本的采集均取得患者知情同意并經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.3 細(xì)胞總RNA提取

向細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入2 mL PBS進(jìn)行沖洗，然后加入1 mL Trizol，用槍反復(fù)吹打。將液體轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL EP管中，加入0.4 mL的氯仿，劇烈搖動(dòng)1 min。室溫靜置2～3 min后，12 000 r/min、4 ℃離心15 min。然后取上清無(wú)色水相到 EP管，加0.5 mL預(yù)冷的異丙醇，在 -20 ℃ 放置 2 h。然后 12 000 r/min、 4 ℃ 離 心10 min，棄去上清，75%乙醇1.0 mL洗滌后，12 000 r/min、4 ℃離心5 min。吸干上清。晾干乙醇10 min，加入DEPC處理水20～30 μL混勻，溶解總RNA，測(cè)RNA的濃度值。

1.4 組織RNA提取

稱取組織樣本0.3～0.5 g，放入預(yù)冷的研磨器中，加入1～2 mL Trizol充分研磨樣品。其余步驟與細(xì)胞提取RNA步驟相同。

1.5 mRNA表達(dá)分析

1.5.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中的基因序列，用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，并由上海生工生物公司合成。引物序列如表1。

表1 引物序列與產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.5.2 RNA逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用Promega逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，步驟參照試劑盒說(shuō)明書，用3 μg的RNA為模板合成cDNA，用SYBR?P remix E x T aqTMⅡ試劑盒在PCR儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：上下引物各0.5 μL，cDNA為9 μL，Mix為10 μL，總體系20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃、40 s；95 ℃、40s，60℃、40 s，72 ℃、50 s，共45個(gè)循環(huán)；72 ℃、5 min。為了檢測(cè)引物的特異性，設(shè)定熔解曲線(60～95℃)。每個(gè)樣本進(jìn)行3個(gè)復(fù)孔檢測(cè)，采用2-△△CT對(duì)PCR結(jié)果進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.6 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)臨床樣本數(shù)據(jù)

肝癌患者基因表達(dá)和臨床資料數(shù)據(jù)從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)獲取(http://tcgadata.nci.nih.gov)。肝癌患者WFDC1 基因的表達(dá)的數(shù)據(jù)集ID為L(zhǎng)IHC.sampleMap/HiSeqV2_PANCAN，肝癌患者相關(guān)臨床病理指標(biāo)的數(shù)據(jù)集ID為TCGA.LIHC.sampleMap/LIHC_clinicalMatrix。獲得具有WFDC1基因表達(dá)數(shù)據(jù)的肝癌患者的肝癌組織331例，并收集臨床病理指標(biāo)(年齡、性別、腫瘤分期、臨床分期)和危險(xiǎn)因素等資料。在331例肝癌患者中有50例肝癌患者具有腫瘤和癌旁組織配對(duì)標(biāo)本。將數(shù)據(jù)庫(kù)中331例肝癌患者WFDC1基因表達(dá)數(shù)據(jù)取中位數(shù)，將高于中位數(shù)的值定義為高表達(dá)，低于中位數(shù)的值定義為低表達(dá)。

1.7 Kaplan-Meier分析

通過(guò)對(duì)WFDC1基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)的整理，我們以WFDC1 mRNA表達(dá)的平均值為界限值將肝癌患者劃分為低表達(dá)與高表達(dá)兩個(gè)組別，用Kaplan-Meier的方法分析WFDC1 mRNA表達(dá)與肝癌患者生存預(yù)后之間的關(guān)系。通過(guò)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)變量的調(diào)整[腫瘤(1+2)期和(3+4)期[10]]，然后分別對(duì)變量使用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析。所有患者結(jié)局的標(biāo)準(zhǔn)均以肝癌引起的死亡。

1.8 特異度和靈敏度分析

通過(guò)對(duì)WFDC1 mRNA表達(dá)的數(shù)據(jù)和臨床資料的整理和分析，主要利用肝癌患者和癌旁組織基因表達(dá)以及腫瘤分期[(1+2)期和(3+4)期]的數(shù)據(jù)，用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)模型分析WFDC1基因表達(dá)作為肝癌患者臨床診斷指標(biāo)的特異度和靈敏度。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)進(jìn)行分析。用t檢驗(yàn)分析WFDC1基因在肝癌組織與癌旁組織間的表達(dá)差異，用方差分析WFDC1基因在惡轉(zhuǎn)細(xì)胞中各個(gè)代數(shù)的表達(dá)差異以及在不同肝癌細(xì)胞中的表達(dá)差異。χ2檢驗(yàn)分析WFDC1基因表達(dá)與不同臨床分期、腫瘤分期的差異以及分析該基因與臨床基本病理指標(biāo)和危險(xiǎn)因素之間的相關(guān)性。通過(guò)ROC曲線模型分析WFDC1基因表達(dá)對(duì)患者臨床診斷的價(jià)值。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 WFDC1 mRNA在肝癌細(xì)胞和MC-LR誘導(dǎo)的L02惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的表達(dá)水平

我們采用qPCR法檢測(cè)了在不同肝癌細(xì)胞株和MCLR誘導(dǎo)的L02惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的WFDC1 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果表明，與L02細(xì)胞比較，WFDC1 mRNA在SMMC-7721、HepG2、Hep3B、Huh-7等4種肝癌細(xì)胞株中均低表達(dá)(圖1A)。同時(shí)隨著MC-LR誘導(dǎo)的L02惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞代數(shù)的不斷增加，WFDC1 mRNA的表達(dá)逐步下調(diào)(圖1B)。

圖1 WFDC1 mRNA在肝癌細(xì)胞株和MC-LR誘導(dǎo)L02惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的表達(dá)水平

2.2 WFDC1 mRNA在肝癌患者癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平

qPCR結(jié)果表明，在40例肝癌患者中，WFDC1 mRNA在癌組織的表達(dá)顯著低于癌旁組織 (圖2，t=5.624，P＜0.01)。

2.3 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中WFDC1 mRNA在肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況

為了進(jìn)一步驗(yàn)證該基因在臨床組織樣品的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們利用genome-cancer(https://genome-cancer.ucsc.edu)網(wǎng)絡(luò)分析WFDC1 mRNA在肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況，見圖3。結(jié)果表明，WFDC1 mRNA在肝癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織中的表達(dá)(圖3B，t=3.551，P＜ 0.01)。在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的50例肝瘤組織及其配對(duì)的50 例癌旁組織中也發(fā)現(xiàn)，WFDC1 mRNA的表達(dá)在肝瘤組織明顯低于癌旁組織。兩組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3C，t=3.990，P＜0.01)，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。

圖2 WFDC1 mRNA在肝癌患者腫瘤及癌旁組織中的表達(dá)水平

2.4 WFDC1 mRNA表達(dá)與肝癌患者臨床指標(biāo)和疾病危險(xiǎn)因素之間的關(guān)系

我們對(duì)WFDC1 mRNA的表達(dá)情況按不同的臨床病理特征和不同的危險(xiǎn)因素進(jìn)行分組分析，以此來(lái)確定該基因的表達(dá)情況與肝癌患者的危險(xiǎn)因素以及臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系。結(jié)果表明，WFDC1 mRNA的表達(dá)在不同腫瘤分期和臨床分期中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。但與患者的年齡、性別、是否飲酒、是否有病毒感染(HBV和/或HCV)等危險(xiǎn)因素?zé)o顯著相關(guān)性(P＞0.05)(表2)。

圖3 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析WFDC1 mRNA在癌旁組織和肝癌組織中的表達(dá)

表2 WFDC1 mRNA表達(dá)情況與肝癌臨床病理特征和危險(xiǎn)因素的關(guān)系

2.5 WFDC1 mRNA表達(dá)與肝癌患者生存預(yù)后之間的關(guān)系

我們采用Kaplan-Meier的方法分析WFDC1 mRNA表達(dá)與肝癌患者生存預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果表明，WFDC1 mRNA表達(dá)與肝癌患者術(shù)后的生存時(shí)間有顯著相關(guān)性，WFDC1 mRNA高表達(dá)患者的術(shù)后生存時(shí)間顯著高于低表達(dá)的患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4A，Logrank=4.80，P＜0.05)。按腫瘤分期進(jìn)行分類分析發(fā)現(xiàn)，在腫瘤(1+2)期中，WFDC1 mRNA高表達(dá)患者的術(shù)后生存時(shí)間顯著高于低表達(dá)患者(圖4B，Log-rank=3.92，P＜0.05)，而在腫瘤(3+4)期的肝癌患者中，低表達(dá)患者的術(shù)后生存時(shí)間與高表達(dá)組無(wú)顯著相關(guān)性(圖2C，Logrank=0.001，P＞0.05)。

2.6 WFDC1 mRNA表達(dá)在肝癌中的診斷價(jià)值

為了更加明確WFDC1 mRNA的表達(dá)在肝癌診斷中的價(jià)值，我們利用ROC模型對(duì)該基因表達(dá)情況進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，WFDC1 mRNA表達(dá)在肝癌中具有較好的特異度和靈敏度，ROC曲線下面積AUC= 0.829，95%CI為0.788～0.871(圖5A)。而在腫瘤(1+2)期，ROC曲線面積AUC=0.834，95%CI為0.789～0.879 (圖5B)。在腫 瘤 (3+4)期 ， ROC曲 線 面 積 AUC=0.832， 95%CI為0.765～0.899(圖5C)。提示該基因是一個(gè)潛在的診斷標(biāo)志物。

圖4 肝癌患者WFDC1 mRNA表達(dá)的Kaplan-Meier生存曲線

圖5 WFDC1 mRNA表達(dá)在肝癌診斷中的ROC曲線

3 討論

WFDC1蛋白含有220個(gè)氨基酸，包括了23個(gè)酸性氨基酸、30個(gè)堿性氨基酸、48個(gè)極性以及65個(gè)疏水氨基酸，同時(shí)大鼠和人的WFDC1基因均含7個(gè)外顯子，并且在外顯子2上幾乎包括了同樣的乳清酸序列[11]。WFDC1蛋白也是乳清酸蛋白家族的一員，這個(gè)家族的特點(diǎn)就是至少含有一個(gè)由50個(gè)氨基酸組成的乳清酸蛋白的序列，其中就包含了由8個(gè)氨基酸高度保守的半胱氨酸殘基所形成的4個(gè)二硫鍵[12]。WFDC1基因定位于16q24染色體，這是癌癥中雜合性頻繁喪失的一個(gè)領(lǐng)域，該基因可能有抑癌因子的功能[13]。WFDC1基因與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展都有聯(lián)系，包括前列腺癌[14]、 乳腺癌[15]、 肝細(xì)胞癌[16]、 黑色素瘤等[8]，并且可能參與抑制細(xì)胞增殖。編碼的蛋白質(zhì)也可能在某些CD4記憶T細(xì)胞對(duì)人類免疫缺陷病毒感染的易感性中起作用[17]。PS20通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞間綴合物的形成而成為HIV-1易感染的CD4+T細(xì)胞的新型標(biāo)志物[18]。目前WFDC1基因與肝癌的發(fā)生和機(jī)制方面的研究比較少，尤其與臨床生存預(yù)后的研究目前還未見報(bào)道。

在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，該基表達(dá)因在癌組織中顯著下調(diào)。同時(shí)在不同的肝癌細(xì)胞株以及MC-LR誘導(dǎo)的惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞中證實(shí)WFDC1 mRNA表達(dá)顯著下調(diào)，由于隨著MC誘導(dǎo)的惡轉(zhuǎn)細(xì)胞代數(shù)的增加，該基因的表達(dá)也逐步下調(diào)，提示該基因參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。通過(guò)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的大樣本數(shù)據(jù)分析，也證實(shí)該基因在腫瘤組織的表達(dá)低于癌旁組織，提示W(wǎng)FDC1可能在肝癌發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮抑癌作用，有必要進(jìn)一步開展系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)研究。

WFDC1 mRNA在肝癌患者生存預(yù)后的分析中表明，WFDC1 mRNA的表達(dá)與腫瘤分期以及臨床分期有顯著相關(guān)性，該基因高表達(dá)患者的術(shù)后生存時(shí)間明顯高于低表達(dá)患者。而與患者的年齡、性別、是否飲酒、是否有病毒感染等危險(xiǎn)因素?zé)o顯著相關(guān)性。這提示我們WFDC1 mRNA的表達(dá)與腫瘤分期有著密切的聯(lián)系，有可能對(duì)肝癌患者生存預(yù)后的判斷有一定的診斷價(jià)值。ROC模型分析表明WFDC1 mRNA的表達(dá)水平在肝癌患者的診斷中具有較高的特異度和靈敏度(AUC=0.829， 95%CI為 0.788～0.871)， 這 提 示 我 們 WFDC1 mRNA的表達(dá)可用于肝癌的初步診斷。由于目前我們只是在肝癌細(xì)胞株和臨床組織標(biāo)本中做了部分驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)以及用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)表達(dá)的數(shù)據(jù)去分析，所以對(duì)于該基因作為分子診斷的生物標(biāo)志物還需要更多的臨床標(biāo)本去驗(yàn)證，而具體的功能還需要更大的樣本去進(jìn)行研究。

綜上所述，WFDC1基因在肝癌中的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及與肝癌患者的生存預(yù)后有密切相關(guān)性，是一個(gè)重要的候選生物標(biāo)志物。同時(shí)WFDC1基因在肝癌中可能是一個(gè)潛在的抑癌基因，有必要進(jìn)一步去研究該基因在肝癌中的機(jī)制及功能，為全面掌握WFDC1基因在腫瘤中的作用奠定基礎(chǔ)。