張方華 許愛梅 李盈 王曄 高珊 姚民秀

青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院1內(nèi)分泌科；2中心實驗室（山東青島 266042）

糖尿病是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率最高的疾病之一。2017年全國慢性非傳染性疾病預(yù)防控制中心發(fā)布的調(diào)查顯示我國糖尿病患病率達(dá)10.9%，糖尿病前期患病率為35.7%［1］。糖尿病在世界范圍內(nèi)呈爆發(fā)性增長，糖尿病及糖尿病前期的防治刻不容緩。Cr3+是維持正常葡萄糖、胰島素和脂肪代謝所必需的微量元素。鉻攝入量不足可以增加患糖尿病的危險性。鎂是細(xì)胞內(nèi)含量最豐富的第二大陽離子，作為高能磷酸化代謝途徑酶的必需輔助因子參與能量代謝、蛋白合成和調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的葡萄糖轉(zhuǎn)運。微小RNA（microRNA，miRNA）是長度約為22個核苷酸的短鏈非編碼RNA，主要是通過轉(zhuǎn)錄抑制作用或者mRNA的降解作用，導(dǎo)致沉默其靶基因的表達(dá)，從而實現(xiàn)其對靶基因的表達(dá)調(diào)控。研究表明，微小RNA可以通過其對靶基因的調(diào)控，影響糖耐量［2］。筆者前期的研究表明，補充鉻、鎂可降低IGT患者血糖，但具體機制不清。本研究通過高通量測序技術(shù)（next generation sequencing，NGS）探討Cr3+和Mg2+聯(lián)合補充對糖耐量異?；颊哐h(huán)miRNA表達(dá)的影響，篩查表達(dá)差異miRNA，探討在糖尿病前期通過微量元素的補充逆轉(zhuǎn)疾病進程的可能的分子機制。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取青島大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院（青島市中心醫(yī)院）2015年1月至2015年12月期間45～59歲的IGT者（符合1999年WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)），排除高鎂血癥、惡性腫瘤及冠心病患者；為治療疾病而服用各種藥物者。本研究經(jīng)青島大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書。自愿參加并簽訂知情同意書者作為研究對象。本研究分為3組，分別是年齡相匹配的正常對照組（10人）、安慰劑對照組（60人）、鉻（120 μg/d）+鎂（200 mg/d）干預(yù)組（60人），干預(yù)時間為3個月。

1.2 實驗方法 干預(yù)前后測定入組患者的空腹血糖（fasting plasma glucose，F(xiàn)PG）、負(fù)荷后2 h血糖（2 hours post glucose?load，2 h PG）、空腹胰島素（fasting insulin，F(xiàn)ins）、血脂水平。按照常規(guī)方法進行血壓、體重、身高及腰圍、臀圍的測量。計算體重指數(shù)（body mass index，BMI=體重/身高2）。計算腰臀比（waist and hip ratio，WHR=腰圍/臀圍）。血糖測定采用葡糖糖氧化酶法，電化學(xué)發(fā)光法測定Fins，全自動生化分析儀檢測血脂水平。計算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA?IR=Fins X FPG/22.5）。

1.3 miRNA測序 循環(huán)miRNA的提取采用美國Qiagen公司的miRNeasy血清/血漿提取試劑盒。采用NGS技術(shù)，檢測3組人群循環(huán)miRNA的表達(dá)。

1.4 熒光定量PCR（qPCR） miRNA的qPCR引物購于廣州市銳博生物科技有限公司（ribobio）。采用SYBR法。采用2?ddCT法進行數(shù)據(jù)分析，內(nèi)參基因為miR?191?5p和miR?16?5p。

1.5 miR?182?5p和miR?96?5p功能富集分析 上述預(yù)測出的共同靶基因進行g(shù)ene ontology（GO）與Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）信號通路分析，采用的軟件為美國Arraystar公司的分析軟件。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad軟件，qPCR的結(jié)果以±s表示。臨床數(shù)據(jù)采用±s的形式表示。應(yīng)用非配對t檢驗及單因素方差分析進行比較。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 受試者的臨床特征 受試者OGTT均符合糖耐量異常診斷標(biāo)準(zhǔn)：FPG≥6.1 mmol/L～＜7.0 mmol/L，2 h PG≥ 7.8 mmol/L～＜11.1 mmol/L。共入組130人，其中正常對照組10人、安慰劑對照組60人、鉻鎂干預(yù)組60人。脫落2人，其中鉻鎂干預(yù)組1例失訪，對照組1例發(fā)現(xiàn)肺部惡性腫瘤退出。三組患者年齡匹配（P＞0.05）。入組前對照組、鉻鎂干預(yù)組FBG、2hPG、Fins等均無統(tǒng)計學(xué)差異（表1）。干預(yù)3個月后，鉻鎂干預(yù)組FBG、2 h PG、HOMA?IR均較對照組降低，而兩組BMI、WHR、Fins及血脂無統(tǒng)計學(xué)差異。見表2。

表1 所有入選受試者入組時一般資料Tab.1 General information of all selected subjects before the intervention ±s

表1 所有入選受試者入組時一般資料Tab.1 General information of all selected subjects before the intervention ±s

組別年齡（歲）性別男/女（%）BMI（kg/m2）FPG（mmol/L）2hPG（mmol/L）Fins（uIU/mL）HOMA?IR TG（mmol/L）TC（mmol/L）LDL?c（mmol/L）HDL?c（mmol/L）WHR正常對照組（n=10）52.89±3.14 4/6（40%）23.75±3.13 4.71±0.54 6.28±0.13 7.40±3.86 1.59±0.81 1.35±1.12 5.02±0.67 2.68±0.78 1.46±0.41 0.82±0.05安慰劑對照組（n=60）52.67±2.65 23/26（38%）24.08±2.51 5.62±0.67 9.46±0.68 13.51±8.03 3.36±2.46 1.96±0.61 5.32±1.02 3.24±0.79 1.30±0.39 0.88±0.06鉻鎂干預(yù)組（n=60）53.01±3.11 24/25（40%）24.16±3.08 5.78±0.66 9.47±0.78 13.40±8.17 3.44±1.91 2.01±0.68 5.37±0.97 3.19±1.28 1.29±0.43 0.89±0.06

2.2 miRNA的差異表達(dá) 提取血漿miRNA后，應(yīng)用Illumina測序技術(shù)進行測序。在3組血漿樣本中，共檢測得到了263個miRNA可與人類的參比前體miRNA相匹配。在這些miRNA中，得到了6個差異表達(dá)的循環(huán)miRNA，分別為miR?182?5p、miR?96?5、miR?27b、miR?21、miR?379和miR?143，在安慰劑對照組、鉻鎂干預(yù)組差異有顯著性，如表3所示。

2.3 qPCR的結(jié)果 為了驗證Illumina測序的結(jié)果，筆者對上述的6個差異表達(dá)的循環(huán)miRNA，miR?182?5p、miR?96?5p、miR?27b、miR?21、miR?379和miR?143，在3組樣本中進行了qPCR的驗證。結(jié)果表明，僅有miR?182?5p、miR?96?5p和miR?27b的表達(dá)趨勢與測序結(jié)果相同，驗證了測序結(jié)果。結(jié)果如圖1所示。

2.4 miR?182?5p與miR?96?5p的功能富集分析miR?182?5p靶基因的功能富集分析發(fā)現(xiàn)與214個GO條目有關(guān)，這214個條目可以分為54個與分子功能相關(guān)，67個與細(xì)胞組份相關(guān)，93個與生物學(xué)過程相關(guān)。信號通路分析表明，與之相關(guān)的信號通路是葡萄糖結(jié)合通路（圖2）。miR?96?5p靶基因的功能富集分析發(fā)現(xiàn)與184個GO條目有關(guān)，這184個條目可以分為41個與分子功能相關(guān)，59個與細(xì)胞組份相關(guān)，84個與生物學(xué)過程相關(guān)。信號通路分析表明，與之相關(guān)的信號通路是phosphati?dylinositol signaling pathway（磷脂酰肌醇信號通路）通路（圖3）。

表2 干預(yù)前后各臨床指標(biāo)變化Tab.2 Changes of clinical data before and after intervention ±s

表2 干預(yù)前后各臨床指標(biāo)變化Tab.2 Changes of clinical data before and after intervention ±s

注：與安慰劑對照組相比，*P＜0.05

組別安慰劑對照組鉻鎂干預(yù)組t值P值例數(shù)59 59 FBG（mmol/L）干預(yù)前5.62±0.67 5.78±0.66 1.30 0.19干預(yù)后5.57±1.35 5.01±1.52*2.11 0.03 2 h PG（mmol/L）干預(yù)前9.46±0.68 9.47±0.78 1.26 0.20干預(yù)后9.14±1.78 7.76±2.57*3.39 0.001 Fins（uIU/mL）干預(yù)前13.51±8.03 13.40±8.17 0.07 0.91干預(yù)后12.49±6.37 12.67±5.41 0.16 0.86組別安慰劑對照組鉻鎂干預(yù)組t值P值例數(shù)59 59 HOMA?IR干預(yù)前3.36±2.46 3.44±1.91 0.19 0.84干預(yù)后3.11±2.23 2.32±1.83*2.11 0.03 WHR干預(yù)前0.88±0.06 0.89±0.06 0.90 0.36干預(yù)后0.86±0.07 0.84±0.08 3.39 0.001 BMI（kg/m2）干預(yù)前24.08±2.51 24.16±3.08 0.15 0.87干預(yù)后23.51±2.55 24.11±2.87 1.20 0.23組別安慰劑對照組鉻鎂干預(yù)組t值P值例數(shù)59 59 TG（mmol/L）干預(yù)前1.96±0.61 2.01±0.68 0.42 0.67干預(yù)后1.86±1.02 1.57±0.84 1.68 0.09 TC（mmol/L）干預(yù)前5.32±1.02 5.37±0.97 0.27 0.78干預(yù)后4.91±0.87 4.84±0.81 0.45 0.65 LDL?c（mmol/L）干預(yù)前3.24±0.79 3.19±1.28 0.25 0.78干預(yù)后3.13±0.82 3.01±0.75 0.82 0.40 HDL?c（mmol/L）干預(yù)前1.30±0.39 1.29±0.43 0.13 0.88干預(yù)后1.46±0.31 1.42±0.53 0.50 0.61

表3 NGS測序結(jié)果Tab.3 NGS sequencing results

3 討論

圖1 定量PCR的結(jié)果Fig.1 Results of quantitative PCR

糖尿病嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量，甚至危及生命，其病死率大于艾滋病、結(jié)核病和瘧疾病死率的總和，大約每6秒就有一個糖尿病患者死亡。從早期的代謝異常到糖尿病的過渡，即從空腹血糖受損（impaired fasting glucose，IFG）和IGT到臨床糖尿病可能需要很多年；然而，大多數(shù)IFG、IGT人群最終發(fā)展為糖尿病。IFG和IGT代表糖耐量正常人群與糖尿病之間的中間狀態(tài)。

圖2 miR?182?5p的功能富集分析Fig.2 miR?182?5p′s functional enrichment analysis

圖3 miR?96?5p的功能富集分析Fig.3 miR?96?5p′s functional enrichment analysis

鉻（三價）和鎂在能量物質(zhì)代謝過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是維持正常葡萄糖、胰島素和脂肪代謝所必需的微量元素，其與胰島素抵抗的關(guān)系一直以來是研究的熱點。鉻是維持正常葡萄糖、胰島素和脂肪代謝所必需的微量元素。以往的研究發(fā)現(xiàn)，鉻可以通過增強胰島素與細(xì)胞結(jié)合、增加胰島素受體數(shù)量、提高胰島β細(xì)胞敏感性、增強胰島素內(nèi)攝和激活胰島素受體激酶來增加胰島素敏感性。鉻（三價）在碳水化合物、脂類和蛋白質(zhì)代謝中起著重要作用；然而，其在分子水平上的作用機制尚不完全清楚。KROL等［3］研究發(fā)現(xiàn)Cr3+可以改善由IL?6、TNF?α、C反應(yīng)蛋白、單核細(xì)胞趨化蛋白-1以及細(xì)胞間黏附分子1（ICAM?1）誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的炎癥反應(yīng)。鎂是很多能量代謝酶的輔酶，鎂缺乏參與了胰島素抵抗的形成。本研究發(fā)現(xiàn)補充微量元素鉻鎂后，IGT患者血糖降低，胰島素抵抗得以改善。

有研究表明，miRNA通過作用于多個通路促進胰島素分泌或調(diào)節(jié)胰島素抵抗，其可能成為治療糖尿病的新靶點。李偉等［4］發(fā)現(xiàn)，妊娠糖尿病患者胎盤組織miRNA表達(dá)異常，且與胰島素信號通路多個靶點有關(guān)。目前有很多報道是關(guān)于潛在的miRNA作為2型糖尿病的生物標(biāo)志物的研究。ZAMPETAKI等［5］報道了在患者發(fā)生2型糖尿病前的數(shù)年，其血漿miR?15a，miR?28?3p，miR?29b，miR?126和miR?223的表達(dá)已發(fā)生改變。另外的一項研究發(fā)現(xiàn)了7種血清來源的miRNAs（miR?9，miR?29a，miR?30d，miR?34a，miR?124a，miR?146a，and miR?375），與NGT的人群相比，這7種血清來源的miRNAs的表達(dá)在T2DM患者人群顯著升高［6］。

本研究中發(fā)現(xiàn)微量元素鉻鎂聯(lián)合補充降低血糖，改善胰島素抵抗的同時，可增加血漿中miR?182?5p和miR?96?5p的表達(dá)。miR?182?5p和miR?96?5p屬于miR?183/96/182基因簇，2003年首先在視網(wǎng)膜中被發(fā)現(xiàn)，以后又陸續(xù)在成骨細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、視網(wǎng)膜和內(nèi)耳組織中被相繼發(fā)現(xiàn)。miR?182?5p可能通過調(diào)控胰島素的合成參與糖尿病發(fā)生。在MIN6胰島β細(xì)胞和原代胰島細(xì)胞中敲除miR?182后，將導(dǎo)致胰島素合成減少，其機制可能是敲除miR?182后胰島素基因的轉(zhuǎn)錄抑制因子Bhlhe22（basic helix?loophelix family，member 22）表達(dá)上調(diào)，胰島素基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性降低。研究表明，miR?182與胰島素抵抗有關(guān)，還與胰島素信號通路（IGF?1）相關(guān)。miR?182通過調(diào)節(jié)肌肉葡萄糖的利用從而調(diào)控糖代謝的平衡［7］。miR?96通過InsR與IRS?1基因抑制飲食誘導(dǎo)的飽和脂肪酸加重肝臟胰島素抵抗［8］。

綜上所述，聯(lián)合補充鉻鎂可降低IGT患者血糖，改善胰島素抵抗。IGT患者miR?182?5p和miR?96?5p表達(dá)降低，補充鉻鎂后可使 miR?182?5p和miR?96?5p表達(dá)升高。聯(lián)合補充微量元素鉻和鎂可能通過增強miR?182?5p和miR?96?5p表達(dá)，而改善IGT患者的糖耐量。