沈照鵬，孫書娟，崔 欣，朱常亮，孟 蕾，江曉路2,,

(1.中國海洋大學 醫(yī)藥學院，山東 青島 266003；2.青島海洋生物醫(yī)藥研究院，山東 青島 266071；3.青島市婦女兒童醫(yī)院，山東 青島 266034；4.中國海洋大學 食品科學與工程學院，山東 青島 266003；5.青島明月集團有限公司 海藻活性物質國家重點實驗室，山東 青島 266400)

紫菜屬紅藻類，在我國有10多個品種，多產于我國江蘇、福建和遼寧沿海,在已知的70多種可供人類食用的海藻中，紫菜具有很高的營養(yǎng)價值[1]。紫菜也具有很好的藥用功效，其性味甘、咸、寒，具有化痰軟堅、清熱利尿、補腎養(yǎng)心和健脾降壓的作用，用于防治甲狀腺腫大、慢性氣管炎，預防動脈硬化及降低血壓[2-3]。我國浙江以北和福建以南地區(qū)以條斑紫菜為主，浙江和福建一帶以壇紫菜為主。紫菜的品種差異往往影響其營養(yǎng)成分含量。

瓊膠是紫菜細胞壁多糖的主要成分之一，由于其黏度高、水溶性低，不易被吸收，因此在功能性應用方面受到很大限制。瓊膠寡糖是瓊膠多糖水解后得到的聚合度為2～10 的低聚糖，又稱瓊膠低聚糖，水溶性好、利于人體吸收，是一種新型的海洋功能性低聚糖。瓊膠寡糖不僅具有功能性低聚糖的一般特性，還具有許多普通寡糖無法替代的生理功能特性，如對微生物的抑菌、增殖腸道益生菌、抗病毒、抗腫瘤和免疫增強、抗炎、抗氧化、吸濕保濕性以及美白作用等方面的生物活性[4-5]。目前，紫菜加工方法主要是簡單的鹽漬和蒸煮。這些方法都是對紫菜進行直接加工，技術含量及附加值低，所得產品的營養(yǎng)也不利于人體吸收。

基于以上紫菜及瓊膠寡糖的營養(yǎng)價值和目前紫菜的加工工藝，筆者利用瓊膠酶降解壇紫菜和條斑紫菜，擬確定出一種最優(yōu)的酶解工藝，并通過對2種紫菜酶解前后總糖、還原糖、蛋白質、氨基酸態(tài)氮、氨基酸、固形物以及灰分等成分的測定與比較，為紫菜的進一步高值化加工和生產提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

條斑紫菜和壇紫菜購于福建申石蘭食品有限公司；瓊膠降解酶由中國海洋大學食品科學與工程學院應用微生物實驗室提供，購自Sigma公司，貨號A6306，用pH 6.0磷酸緩沖液稀釋至5 U/mL，于4 ℃保存，備用；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

HH·B11420型電熱恒溫培養(yǎng)箱，山東濰坊醫(yī)療器械廠；HR-8801M型微波爐，青島海爾微波制品有限公司；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；HL-26型海菱多功能食品粉碎機，上海海菱電器有限公司；S-433D型全自動氨基酸分析儀，德國Sykam公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 設計紫菜酶解液制備的正交試驗

根據(jù)酶解紫菜原液的現(xiàn)有工藝參數(shù)與前人實驗結果以及紫菜酶解的特性[6]，確定因子和水平如表1所示。

表1 紫菜酶解因子水平

按表1配制不同濃度的紫菜勻漿液，浸泡30 min，煮沸后冷卻至相應溫度，保溫30 min，加酶液，進行酶解反應。分別在2、2.5和3 h后煮沸,終止酶解反應。冷卻后離心，取上清液，測其還原糖吸光值。

1.3.2 紫菜酶解液還原糖的測定

根據(jù)二硝基水楊酸(DNS)法測定還原糖吸光值，繪制葡萄糖標準曲線[7-9]。在具塞比色管中加入0.5 mL樣品液，再加入1 mL DNS，沸水浴5 min，迅速冷卻后，用蒸餾水定容到25 mL，于520 nm下測定吸光值。

1.3.3 紫菜原液和酶解液營養(yǎng)成分的測定

根據(jù)1.3.1節(jié)結果得紫菜的最優(yōu)酶解條件并制備2種紫菜酶解液，同時用蒸餾水代替酶配制2種紫菜原液，對各營養(yǎng)成分含量進行測定并作比較。

總糖測定采用苯酚-硫酸法，根據(jù)文獻[10-11]繪制總糖標準曲線。將紫菜原液或酶解液稀釋100倍后，取1 mL稀釋液于試管中，加0.3 mL質量分數(shù)為6%的苯酚、1.5 mL濃硫酸，靜置20 min，在波長490 nm下測吸光值?？瞻子? mL蒸餾水代替。

還原糖測定采用DNS法，蛋白質測定采用凱氏定氮法[12]，氨基酸態(tài)氮測定采用甲醛值法[13]，氨基酸測定采用氨基酸自動分析儀，可溶性固形物測定參照文獻[14]進行，灰分測定參照文獻[15]進行。

1.3.4 紫菜寡糖寡糖分子量分布的測定

用3倍的乙醇將海藻汁中的寡糖沉淀，離心去除上清液，用蒸餾水溶解，離心去沉淀，上清液用電噴霧電離質譜儀(TSQ LC/MS/MS,Finnegan公司)來測定每種寡糖的分子量。電噴霧電離質譜(ESI-MS)采用陰離子模式。樣品于甲醇-H2O(體積比為1∶ 1)(10 pmol/mL) 溶液中溶解，用注射泵以5 μL/min的速度注入。掃描范圍100～1 100，毛細管溫度250 ℃。

2 結果與討論

2.1 紫菜酶解液制備的正交試驗

紫菜酶解正交試驗結果如表2所示。由表2可知，四因素的影響水平從大到小的順序為C、A、B、D，即酶與底物配比和反應時間對紫菜酶解效果的影響最大，其次是溫度和料液比。因此，最佳酶解工藝組合為A3B3C3D1，即酶解3 h、38 ℃、酶與底物配比為4.0∶ 2(mL/g)、料液比為1∶ 30。

表2 紫菜酶解正交試驗結果

2.2 紫菜原液和酶解液營養(yǎng)成分的測定

2.2.1 總糖含量

2種紫菜酶解前后總糖質量分數(shù)變化如表3所示。由表3可知：壇紫菜、條斑紫菜酶解液總糖含量均有所增加，尤以壇紫菜更顯著，每克紫菜粉增加43.68 mg總糖，表明瓊膠酶的加入可以有效提高總糖含量。可能因為：一方面，紫菜的組織結構經(jīng)煮沸破壞后，再經(jīng)過充分的酶解作用，包含各種糖類的營養(yǎng)物質更好地溶出[16]；另一方面，作為紫菜細胞壁主要成分,較難溶的瓊膠在瓊膠酶的作用下降解為易溶的、具有還原性的單糖或雙糖等瓊膠寡糖。通過比較可知，酶解前后的總糖含量均是壇紫菜大于條斑紫菜。

表3 2種紫菜酶解前后總糖含量(x±s,n≥3)

注:以紫菜粉計算。

2.2.2 還原糖含量

2種紫菜酶解前后還原糖含量變化如表4所示。由表4可知：酶解前紫菜細胞中的糖類物質主要以多糖的形式(主要是瓊膠)存在，故還原糖含量很少(只有0.383 mg/g)，經(jīng)瓊膠酶降解后，還原糖含量顯著增加，每克壇紫菜和條斑紫菜的還原糖增加量分別為14.871和13.561 mg。這可能是因為紫菜細胞中的瓊膠被酶降解為單糖或雙糖等具有還原性的寡糖。瓊膠寡糖的特殊生物活性及生理功能[5]大大提高了紫菜酶解液的營養(yǎng)價值。2種紫菜在酶解前的還原糖含量差別不大，酶解后壇紫菜稍大于條斑紫菜。

表4 2種紫菜酶解前后還原糖含量(x±s,n≥3)

注:以紫菜粉計算。

2.2.3 蛋白質含量

2種紫菜酶解前后蛋白質含量變化如表5所示。由表5可知，紫菜酶解前后蛋白質含量基本不變。這是因為酶具有專一性，瓊膠酶只能降解瓊膠，對蛋白質不起作用。紫菜的細胞結構經(jīng)酶解破壞，胞內蛋白質等營養(yǎng)物質的溶出可能會造成蛋白質含量的增加，這從條斑紫菜酶解前后蛋白質的含量測定結果可以看出。比較2種紫菜可知，條斑紫菜酶解前后蛋白質含量均比壇紫菜稍大。

表5 2種紫菜酶解前后蛋白質含量(x±s,n≥3)

注:以紫菜粉計算。

2.2.4 氨基酸態(tài)氮含量

酶解作用能夠破壞紫菜的細胞結構，使細胞內的營養(yǎng)物質溶出。2種紫菜酶解前后氨基酸態(tài)氨含量如表6所示。由表6可知，經(jīng)瓊膠酶降解后，2種紫菜氨基酸態(tài)氮的含量均明顯提高，尤以條斑紫菜更顯著，每克紫菜粉增加2.176 mg氨基酸態(tài)氨。細胞內氨基酸的溶出，使得紫菜汁呈味物質增加，大大提高了其鮮味和營養(yǎng)價值。條斑紫菜氨基態(tài)氮含量的增加量約是壇紫菜的3倍。

表6 2種紫菜酶解前后氨基酸態(tài)氮含量(x±s,n≥3)

注：以紫菜粉計算。

2.2.5 氨基酸含量

紫菜富含游離氨基酸，食用時極易擴散，可與口腔內多種味覺受體作用，故能讓人感到食物的美味。研究認為，紫菜中氨基酸含量越高，包含的呈味氨基酸越多，味道就越濃厚；且紫菜等級與所含呈味氨基酸的含量多少呈平行關系[17-18]。表7為2種紫菜酶解前后氨基酸組成和含量的變化。由表7可知：壇紫菜與條斑紫菜在蛋白質的氨基酸組成和含量上均有明顯的差異。條斑紫菜液含17種氨基酸較壇紫菜(14種)豐富，且獨有必需氨基酸甲硫氨酸和色氨酸。雖然條斑紫菜原液和酶解液中所含氨基酸總量(862、1 005 mg/L)約為壇紫菜(441、439 mg/L)的2倍，但必需氨基酸在其總氨基酸中相對比例比壇紫菜中的低。酶解后，條斑紫菜液中氨基酸含量比原液高出16.6%，其原因可能為酶解作用游離出與糖結合的部分氨基酸，使其氨基酸總量有所增加。呈味氨基酸為2種紫菜總氨基酸的主要成分，分別占總氨基酸含量的66.9%和77.6%，其中鮮味氨基酸(Glu和Asp)占28.8%和22.3%；甜味氨基酸(Ser、Gly、Ala和Pro)占38.1%和55.3%；條斑紫菜呈味氨基酸含量明顯高于壇紫菜，尤其甜味氨基酸所占比例較高，而壇紫菜中鮮味氨基酸略高于條斑紫菜。酶解后，壇紫菜中氨基酸總量變化不大，條斑紫菜液中氨基酸含量比原液高出16.6%，其原因可能為酶解作用游離出與糖結合的部分氨基酸，使其氨基酸總量有所增加。酶解后，壇紫菜中甜味氨基酸含量增高了24.36%，對提高紫菜液的風味性具有增強作用。而壇紫菜酶解液中氨基酸總量略微減少，可能因為酶解不夠充分。

表7 2種紫菜酶解前后氨基酸組成和含量

注：*所標為人體必需的氨基酸。

2.2.6 可溶性固形物含量

2種紫菜酶解前后可溶性固形物含量變化如表8所示。由表8可知：2種紫菜酶解前后可溶性固形物的含量均顯著增加，均約增至酶解前的1.5倍。由總糖、還原糖含量測定結果可知，酶解液中兩者含量的增加可能提高了可溶性固形物的含量。此外，酶解作用使營養(yǎng)物質更好地溶出也是其含量增加的重要原因。壇紫菜酶解前后可溶性固形物的含量均比條斑紫菜稍大。

表8 2種紫菜酶解前后可溶性固形物含量(x±s,n≥3)

注：以紫菜粉計算。

圖1 2種紫菜寡糖分子量分布Fig.1 Molecular weight distribution of two kinds of Porphyra

2.2.7 灰分含量

2種紫菜酶解前后灰分含量如表9所示。

表92種紫菜酶解前后灰分含量(x±s,n≥3)

Table9ResultsofashcontentaroundtwoPorphyrahydrolysis(x±s,n≥3)

樣品酶解前灰分質量分數(shù)/(mg·g-1)酶解后灰分質量分數(shù)/(mg·g-1)壇紫菜5.28±0.375.28±0.01條斑紫菜3.04±0.063.04±0.71

注：以紫菜粉計算。

由表9可知：酶解前后紫菜液中的灰分含量幾乎不變，這是因為瓊膠降解酶只降解瓊膠，且降解不產生無機成分。比較2種紫菜可知：酶解前后壇紫菜灰分含量分別為條斑紫菜的1.8倍、1.7倍，可能是因為2種紫菜品種和產地不一致，導致其細胞結構、營養(yǎng)成分不同。

2.3 紫菜寡糖分子量分布

紫菜寡糖分子量分布如圖1所示。由圖1可知，在瓊膠裂解酶的作用下，紫菜中富含的大分子瓊膠充分裂解生成了分子大小不一的眾多褐藻寡糖。經(jīng)陰離子電噴霧電離質譜測得酶解所得的紫菜寡糖的分子量分布均為500～1 000，聚合度為3～5，以三糖為主。紫菜多糖通過瓊膠酶降解后獲得的寡糖產物組成上以半乳糖為主，含硫酸基，不同聚合度寡糖組分間單糖組成相差不大[19]?，F(xiàn)有研究表明，紫菜寡糖具有抗氧化、免疫調節(jié)和抗腫瘤等活性，這些活性與寡糖聚合度之間存在密切關系，聚合度在2～6時活性較高[20-22]。據(jù)此可知，通過本文所述工藝酶解后所得的紫菜寡糖處于高生理活性寡糖聚合度范圍，具有良好的生理活性，增添了紫菜酶解汁的功能性。

綜上，瓊膠酶只專一作用于瓊膠，且產物為具有還原性的瓊膠寡糖。雖然酶解作用可使紫菜細胞內的營養(yǎng)物質溶出，其他物質含量可能有所增加(氨基酸態(tài)氮、氨基酸和可溶性固形)，但是紫菜酶解前后總糖及還原糖的含量變化才是評價瓊膠酶作用效果的主要指標。同時，瓊膠寡糖具有其他普通低聚糖所沒有的特性，如不被消化酶分解、不會被腸內細菌分解且無熱量產生等，故可用作高甜度甜味劑的充填劑及分散劑，用于飲料、面包、調味品及面條等低熱量食品的生產[23-25]。本研究得到了含有瓊膠寡糖混合物的酶解液，但對瓊膠寡糖的具體組成及性質還有待進一步研究。

此外，酶解作用不僅能夠大大降低紫菜汁的黏度、提高其營養(yǎng)價值，而且使得紫菜汁具有甘鮮味濃的良好口感[16]，使其既可作為高營養(yǎng)的即食食品飲用，也可應用于紫菜制品，如紫菜醬油、紫菜調味品等的生產。如此，不僅拓寬了紫菜產品的開發(fā)利用空間，也必定會得到較高的收益。

3 結論

通過正交試驗確定了紫菜酶解的最佳工藝：料液比為1∶ 30 (V/V)，酶液與底物量比為4.0∶ 2(mL/g)，溫度38 ℃，反應時間3 h。相比較鹽漬和蒸煮，該工藝可行，重復性較好。對壇紫菜和條斑紫菜酶解液、原液的成分進行測定與比較，結果表明，瓊膠酶可有效降解壇紫菜和條斑紫菜，并能顯著提高總糖、還原糖、氨基酸態(tài)氮、氨基酸及可溶性固形物的含量，其中總糖和還原糖的增加量最為突出，每克紫菜粉分別增加43.68 mg總糖和14.871 mg還原糖；蛋白質、灰分在酶解前后含量變化不大。綜合比較可知，壇紫菜被瓊膠酶的降解效果優(yōu)于條斑紫菜，更適宜進一步高值化利用。