耿文超，關(guān)今韜,2，程 申，贠軍賢

(1.浙江工業(yè)大學 化學工程學院 綠色化學合成技術(shù)國家重點實驗室培育基地，浙江 杭州 310014；2.浙江大學 化學工程與生物工程學院,浙江 杭州 310027)

在全球益生菌發(fā)酵類食品中，乳桿菌發(fā)酵食品創(chuàng)造的價值占總量的20%[1]。干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)是乳桿菌屬的重要成員，它可以在腸道內(nèi)大量存活，通過調(diào)節(jié)腸道菌群失衡改變腸道微生態(tài)環(huán)境，增強人體免疫力，對人體發(fā)揮著益生菌的作用，是人類“健康三益生菌”之一。

副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)是由Collins等[2]首次提出從干酪乳桿菌亞種中劃分出來的新種。2008年，國際細菌分類委員會(Judicial Commission of the International Committee on Systematics of Bacteria)駁回了Dick等將其歸入干酪乳桿菌屬的分類[3]，重新將副干酪乳桿菌及其亞種劃分出來。目前為止，其分類學地位一直存在爭議。副干酪乳桿菌廣泛存在于人體口腔[4]及腸道[5]，發(fā)酵乳制品(尤其是奶酪)和植物原料發(fā)酵物(泡菜、酒和飼料)等[6]諸多環(huán)境中,它具有干酪乳桿菌屬調(diào)節(jié)腸道和增強免疫力等益生功能，代謝產(chǎn)生的細菌素具有優(yōu)良的抑菌性能。因此，在食品、醫(yī)療保健等領(lǐng)域能夠發(fā)揮重要作用。近年來，副干酪乳桿菌在其他領(lǐng)域的應用有所拓展，作為潛在的重要工業(yè)微生物，可以用來合成高值有機酸，如L-乳酸和苯乳酸[7-8]；另外，隨著越來越多的細胞在表面酶展示技術(shù)的發(fā)展及其在生物技術(shù)和疫苗領(lǐng)域的應用，副干酪乳桿菌以其優(yōu)異的生物安全性及相對較厚的細胞膜，使其得以作為生物活性分子尤其是蛋白質(zhì)和酶的表面展示平臺，這種特性引起了人們的注意。

本文中，筆者對副干酪乳桿菌的篩選鑒定、功能特性及近幾年在食品工業(yè)、微膠囊技術(shù)、生產(chǎn)乳酸或苯乳酸以及微生物細胞表面酶展示等新領(lǐng)域的應用研究進展進行綜述分析。

1 副干酪乳桿菌的篩選鑒定

乳桿菌群中的干酪乳桿菌群數(shù)量較多，其中副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌及干酪乳桿菌三種菌親緣結(jié)構(gòu)相近[1,6]，很難利用傳統(tǒng)的方法進行區(qū)分。目前，對副干酪乳桿菌菌株鑒定，常用分子生物學技術(shù)(如,16S rDNA序列同源性分析)，并結(jié)合發(fā)酵過程中糖類同化能力(API CH檢測系統(tǒng))及代謝產(chǎn)物、PCR擴增等技術(shù)，進行新菌株的鑒定。2005年，Komatsuzaki等[9]從發(fā)酵魚制品中篩選出1株高產(chǎn)γ-氨基丁酸(GABA)的乳酸菌菌株NFRI 7415，用16S rDNA序列檢測表明，其與L.paracaseiJCM 8130同源性達99.8%；通過API CH 檢測系統(tǒng)檢測其對不同糖類的同化能力，證實其為副干酪乳桿菌。2010年，Wang等[10]從新生嬰兒糞便和泡菜中分離得到5株乳桿菌菌株，分別通過16S rRNA引物擴增和API 50CHL檢測系統(tǒng)并結(jié)合代謝產(chǎn)乳酸的類型，分離得到1株能夠代謝產(chǎn)生L-乳酸的副干酪乳桿菌L.paracaseiF08。2017年，Sunthornthummas等[11]從工廠變質(zhì)發(fā)酵牛奶中分離得到一株菌，經(jīng)過API 50 CHL檢測其與副干酪乳桿菌同源性達99.7%；結(jié)合16S rDNA序列和PCR擴增等技術(shù)，證明其為副干酪乳桿菌，與干酪乳桿菌成功區(qū)分開。由此可見，通過16S rDNA序列檢測、API CH檢測系統(tǒng)并結(jié)合代謝產(chǎn)物、PCR擴增等方法，可以快速、準確地對乳桿菌屬中的副干酪乳桿菌進行鑒定，這是目前最有效的鑒定方法。

2 副干酪乳桿菌的功能特性

2.1 生理特性

副干酪乳桿菌具有良好的生理功能，它不僅可以通過控制腸道的微生物菌落影響著人體的消化系統(tǒng)，調(diào)節(jié)人體腸道群，增強免疫力，而且還具有良好的耐酸耐膽鹽特性[12-13]，口服實驗證明其為安全有效的益生菌株。Marzotto等[14]用含有副干酪乳桿菌的發(fā)酵酸奶連續(xù)喂食12～24個月大的嬰兒4周，7 d后對嬰兒糞便取樣檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：副干酪乳桿菌在92%的嬰兒糞便樣品中含量最高，成為人體內(nèi)乳桿菌的主要菌群；隨后逐漸穩(wěn)定，說明其能夠在人體內(nèi)定植生長。Verdenelli等[15]對50名健康的意大利成年人進行分組試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：副干酪乳桿菌在人體內(nèi)的耐受性很好，服用過鼠李糖菌L.rhamnosusIMC 501和副干酪乳桿菌L.paracaseiIMC 502的成年人腸道蠕動明顯加強，對于腸道和人體排便規(guī)律等起到了良好的調(diào)節(jié)作用。此外，副干酪乳桿菌還可增強宿主對微生物病原體的抵抗力，增強免疫球蛋白數(shù)量。Calder等[16]通過在健康人體內(nèi)通過服用含副干酪乳桿菌的牛奶，建立疫苗接種模型調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，42 d后進行對比,結(jié)果發(fā)現(xiàn):無論在人體血漿(IgG1、IgG3)還是唾液中(IgA)特異性抗體數(shù)量較之前都有明顯增加，說明副干酪乳桿菌可以安全有效地提高人體免疫力，良好的生理功能使得副干酪乳桿菌在醫(yī)療保健方面具有重要的研究價值。

2.2 抑菌性能

副干酪乳桿菌在代謝過程中能夠產(chǎn)生細菌素[17]，能夠抑制腸道中的有害菌。細菌素多為有抑菌活性的多肽類物質(zhì)，對抑制病原菌、調(diào)節(jié)腸道平衡發(fā)揮著重要的作用。近年來，國內(nèi)外對副干酪乳桿菌抑菌性和細菌素的研究逐步深入，已報道了多種新的細菌素。

Hassan等[18]從酵母發(fā)酵液中分離得到的副干酪乳桿菌亞種(L.paracaseissp.toleransL17)，可以有效地抑制層生鐮刀菌(FusariumproliferatumM5689)、禾谷鐮刀菌(FusariumgraminearumR4053)和白曲霉(AspergilliumcandidusC25)等產(chǎn)毒素真菌。Ashokkumar等[19]從生驢奶中分離篩選得到了1株副干酪乳桿菌，該菌株產(chǎn)生的細菌素粗提物對鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)有很強的抑制作用，其最小抑菌濃度(MIC)指數(shù)為128 μL。Wannun等[4]從人體口腔分離出1株副干酪乳桿菌株L.paracaseiSD1，其培養(yǎng)液經(jīng)沉淀、過濾、層析等分離，得到了抑菌活性物質(zhì)“Paracasin SD1”，經(jīng)SDS-PAGE分析表明，其分子量為2.402 8×104，對口腔致病菌有很好地抑制作用。雷虹等[20]自乳酸菌發(fā)酵泡菜液中分離出副干酪乳桿菌株L.paracaseiHD1.7，其代謝合成分子量約1.4×104的肽類抑菌物，對大腸桿菌(E.coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、李斯特氏菌(Listeriasp.)和沙門氏菌(Salmonellasp.)等很多致病菌的生長都有抑制作用。Miao等[21]從西藏發(fā)酵牛奶中分離鑒定獲得1株副干酪乳桿菌亞種L.paracaseisubsp.toleransFX-6，其能夠產(chǎn)生分子量為2 114的新型細菌素F1，對細菌和真菌均有抑制作用。Li等[22]將副干酪乳桿菌株L.paracaseiHD1.7與枯草桿菌進行混合培養(yǎng)，觀察到由于其產(chǎn)生的細菌素“Paracin 1.7”的作用，使枯草桿菌的生長受到抑制。林曉龍等[23]從內(nèi)蒙古傳統(tǒng)乳制品中分離鑒定出1株副干酪乳桿菌L.paracaseiQ-1-4，其發(fā)酵上清液對鼠傷寒沙門氏菌(SalmonellatyphimuriumCMCC50115)具有抑制作用，經(jīng)蛋白酶處理后抗菌活性下降，說明所產(chǎn)抗菌物質(zhì)為蛋白類物質(zhì)。副干酪乳桿菌及其對多種目標菌具有顯著的抑制作用，現(xiàn)總結(jié)于表1。總體來看，國內(nèi)外已經(jīng)開始對副干酪乳桿菌抑菌性能及新型細菌素方面進行系統(tǒng)研究，這些新型細菌素在食品工業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣闊的應用前景。

表1 副干酪乳桿菌抑菌作用

3 副干酪乳桿菌的應用研究

3.1 乳制品和功能食品

大多數(shù)副干酪乳桿菌株來源于傳統(tǒng)的干酪和酸奶[1]，能夠在乳品中很好地生存，同時還有調(diào)節(jié)風味的作用。Van Hoorde等[24]選取2株副干酪乳桿L.paracaseiR-40926和R-40937，觀察到其在干酪中很好地生長，同時發(fā)酵過程中還代謝產(chǎn)生了酶和其他調(diào)節(jié)風味的物質(zhì)。Poveda等[25]將副干酪乳桿菌L.paracaseissp.CECT 7882加入奶酪中，檢測到奶酪中的游離脂肪酸和醇類等物質(zhì)都有所增加，較傳統(tǒng)的奶酪風味質(zhì)量明顯提升。除了乳制品，副干酪乳桿菌在肉制品的應用研究中也有少量報道[26-27]。

副干酪乳桿菌在疫苗和功能食品中也有潛在的應用前景[28-29]。Nocerino等[29]將377個12～48個月大的嬰兒分為3組進行對比，其中兩組分別食用含有副干酪乳桿菌L.paracaseiCBA L74的發(fā)酵牛奶和大米，另一組則沒有食用含副干酪乳桿菌菌株的食物，90 d后發(fā)現(xiàn)，兩組服用過含該菌種食物的嬰兒無論是對常見傳染病還是呼吸道感染、急性腸胃炎等的免疫能力都較未服用過的要高，說明副干酪乳桿菌對于嬰兒疾病的免疫能力具有增強作用。

3.2 副干酪乳桿菌微膠囊

為了防止副干酪乳桿菌在食品應用中失去活性，利用細胞微膠囊技術(shù)對菌體進行包埋，可以保護菌的活性[1,30]。常用的微膠囊膜材包括乳蛋白質(zhì)、糊精、海藻糖及海藻酸鈉等。Thomas等[31]以乳蛋白為載體，通過凝乳酶的酶促誘導凝膠化作用，制備了副干酪乳桿菌微膠囊，在pH 2.5條件下培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)細胞成活率較未包埋細胞顯著提高。David等[32]通過噴霧干燥法將副干酪乳桿菌包埋入以麥芽糖糊精和海藻糖為基質(zhì)的微膠囊中，研究微膠囊時材料濃度對細胞成活率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌種活性達60%以上。Ortakci等[33]以海藻酸鹽為載體，將L.paracaseiLBC-1e包埋制備得到海藻酸鹽微膠囊，在用磷酸鹽模擬的胃液環(huán)境下包埋細胞成活率較于未包埋細胞成活率優(yōu)勢明顯。Teanpaisan等[30]將來自于人體口腔中的副干酪乳桿菌L.paracaseiSD1菌株包埋入海藻酸鹽顆粒中，在海藻酸鹽質(zhì)量濃度為20 g/L、CaCl2濃度為0.05 mol/L條件下，制備得到的副干酪乳桿菌微膠囊在果汁中冷藏56 d后，比未包埋菌株活性要高得多。

但是，針對食品和藥品應用目的之微膠囊對包埋材料和菌株有嚴格的要求，現(xiàn)有的副干酪乳桿菌微膠囊包埋技術(shù)尚不成熟，使得其在食品或藥品工業(yè)中的應用較少。因此，菌種的進一步選育、新膠囊材料的研究以及適用于工業(yè)化制備的微膠囊包埋技術(shù)的研究，是需要進一步探索的方向。

3.3 L-乳酸的制備

乳酸是一種重要有機酸，其結(jié)構(gòu)簡單，有D型和L型兩種光學異構(gòu)體。乳酸需求量大，在全球范圍內(nèi)被廣泛應用于生物、醫(yī)藥和新材料等諸多工業(yè)領(lǐng)域[34]?；瘜W合成法生產(chǎn)乳酸為D,L-乳酸，而發(fā)酵方式生產(chǎn)可以得到光學純度很高的D-或者L-乳酸。目前，全球70%以上的乳酸采用發(fā)酵方式生產(chǎn)，主要為L-乳酸；而D-乳酸由于高產(chǎn)菌株少，目前尚沒有規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)。副干酪乳桿菌在發(fā)酵過程中可以利用糖類原料，進而可以大量生產(chǎn)高純度的L-乳酸[27]，總結(jié)相關(guān)研究結(jié)果于表2中。

Moon等[35]利用從土壤中分離得到1株副干酪乳桿菌亞種CHB2121，在含有200 g/L葡萄糖的培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)出192.00 g/L乳酸，L-乳酸光學純度達96.6%，產(chǎn)率為0.96 g/g，生產(chǎn)強度達3.99 g/(L·h)；Choi等[36]以菊芋塊莖中的菊粉型糖類為底物，利用副干酪乳桿菌KCTC13169和KCTC13090，發(fā)酵合成了乳酸，其中KCTC13169乳酸產(chǎn)量是干酪乳桿菌KCTC3109發(fā)酵產(chǎn)乳酸量的6倍，發(fā)酵過程無酸性物質(zhì)或者水解酶存在，乳酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率分別達到92.50 g/L和98%，L-乳酸純度達93.2%。Nguyen等[37]以微藻中的糖類作為底物，通過副干酪乳桿菌LA104發(fā)酵，發(fā)酵合成的L-乳酸質(zhì)量濃度達37.11 g/L，生產(chǎn)強度為1.03 g/(L·h)，光學純度達95.7%，說明微藻也是大規(guī)模生產(chǎn)L-乳酸的潛在底物。Kuo等[38]通過敲除D-乳酸脫氫酶基因改造的L.paracasei7B菌株，對木質(zhì)纖維素原料底物抑制具有耐受性，通過分批補料方式發(fā)酵葡萄糖，合成215 g/L的L-乳酸；利用木質(zhì)素和稻草水解物為原料進行發(fā)酵，產(chǎn)L-乳酸質(zhì)量濃度達99.00 g/L，生產(chǎn)強度分別為(2.25～3.23)、5.27 g/(L·h)。Tian等[39]還通過在副干酪乳桿菌細胞內(nèi)亞克隆NADH生物傳感器，監(jiān)控環(huán)境變化對L-乳酸發(fā)酵過程的影響規(guī)律，結(jié)果表明：胞外氧化還原電勢顯著影響胞內(nèi)氧化還原條件、細胞生長和代謝，如隨著通氣量的增加、氧化還原電勢的改變，L-乳酸總生產(chǎn)強度得到提升，但總產(chǎn)率有降低的趨勢。

表2 有關(guān)發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的副干酪乳桿菌菌株

雖然副干酪乳桿菌發(fā)酵液中L-乳酸的質(zhì)量濃度可達200 g/L，而且產(chǎn)率已有大幅度提高，在大規(guī)模生產(chǎn)L-乳酸方面有廣闊前景。但是，目前這些工作主要處于實驗室研究階段，鮮有中試規(guī)?；蚬I(yè)規(guī)模的研究數(shù)據(jù)，因為已經(jīng)報道的研究所采用的底物成本較高。因此，采用低廉的底物進行發(fā)酵，并開展中試和大規(guī)模制備方面的探索，是目前亟須開展的工作。

3.4 苯乳酸的合成

苯乳酸是一種新的高附加值有機酸，具有廣譜的抑菌性。由于其自身優(yōu)良的性能，在食品、制藥、組織工程等領(lǐng)域有重要應用前景。苯乳酸主要通過微生物發(fā)酵或生物轉(zhuǎn)化法進行合成，合成苯乳酸的菌株以植物乳桿菌、干酪乳桿菌及其他乳酸菌為主[40]，較化學合成法具有反應條件溫和、無需高毒溶劑等優(yōu)點。

副干酪乳桿菌也可以合成苯乳酸。劉戈等[7]報道了將副干酪乳桿菌(L.paracaseiW2)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加苯丙酮酸，并對發(fā)酵條件進行優(yōu)化，使得苯乳酸的產(chǎn)量達801 mg/L，比優(yōu)化前提高1.4倍[8]；其合成方法與干酪乳桿菌轉(zhuǎn)化合成苯乳酸的方法(以苯丙酮酸為底物)相似[41]。最近，Valerio等[42]向8株乳酸菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入苯丙酮酸，通過比較前后抑菌活性的變化，結(jié)果表明：由于加入苯丙酮酸促進了苯丙酮酸衍生物的生成，發(fā)酵液的抑菌活性有明顯提高；在培養(yǎng)基加入苯丙酮酸后，副干酪乳桿菌株L.paracasei2.1發(fā)酵合成的苯乳酸量是加入前的6倍，抗真菌活性也顯著提高。

副干酪乳桿菌通過微生物轉(zhuǎn)化法合成苯乳酸的研究剛剛起步，主要集中在轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化和抑菌性研究中，轉(zhuǎn)化合成機制的研究還沒有開展，高產(chǎn)菌株仍然很少，目前尚沒有工業(yè)化生產(chǎn)。因此，篩選高效菌株，進行菌株的基因工程改造，進一步優(yōu)化發(fā)酵和轉(zhuǎn)化條件，揭示轉(zhuǎn)化合成機制，是下一步需要研究解決的問題。

3.5 細胞表面酶的展示

生物酶在生物轉(zhuǎn)化反應中對底物識別特異性強，反應通常在水溶液中進行。采用細胞酶表面展示技術(shù)，對酶進行固定化和展示，可以提高全細胞催化劑的效率，并能夠使酶得到重復利用，有助于進一步降低成本。近幾年其在生物轉(zhuǎn)化、全細胞催化及疫苗開發(fā)等領(lǐng)域引起了關(guān)注[43-44]，其中,革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌、惡臭假單胞菌(P.putida)，革蘭氏陽性菌，如谷氨酸棒桿菌(C.glutamicum)、乳酸菌屬和芽孢桿菌屬(B.subtilis)內(nèi)生孢子等，都被用于細胞表面酶展示，構(gòu)建嶄新的全細胞催化劑。

乳酸菌屬表面展示以其優(yōu)異的生物安全性受到了重視，其中研究較多的是乳球菌和乳桿菌屬。副干酪乳桿菌作為重要的細胞表面酶展示微生物，近期也是研究熱點。Velikova等[45]對兩種不同數(shù)量肽聚糖結(jié)合位點的糖苷酶InuB41和InuLC1在副干酪乳桿菌表面的展示進行了研究，通過優(yōu)化發(fā)酵條件及展示酶的純化和性能測試，結(jié)果表明:兩種酶分子量都在1.0×105左右，其生物特性并沒有因為錨定部位的不同而受影響；同時，兩種酶對底物特異性不同，InuB41對菊粉有很強的特異性，而InuLC1則對果糖特異性強。這種副干酪乳桿菌細胞表面展示糖苷水解酶，可以作為嶄新的細胞工廠，能夠同時利用淀粉和菊粉混合底物，在新的功能性食品及生物化學品的合成方面具有廣闊前景。這種方法常常不需要基因改造，克服了生物安全性問題，比傳統(tǒng)的固定酶技術(shù)酶活性好，暴露完全。因此，可以將外源融合蛋白(包含活性酶)通過副干酪乳桿菌細胞錨定單元錨定于細胞外壁，構(gòu)建新的全細胞催化體系，使其在細胞表面展示，發(fā)揮特定功能，在生物技術(shù)領(lǐng)域有著廣泛的應用前景。

4 展望

副干酪乳桿菌作為乳桿菌群的重要成員，具有優(yōu)良的抑菌性能，在腸道調(diào)節(jié)、增強免疫力等方面發(fā)揮著益生作用。它的篩選和鑒定可以利用分子生物學技術(shù)，如16S rDNA序列同源性分析，并結(jié)合發(fā)酵過程中糖類同化能力及代謝產(chǎn)物和PCR擴增等方法。副干酪乳桿菌的應用研究主要集中在乳制品與功能食品、菌體細胞微膠囊技術(shù)、L-乳酸制備、苯乳酸合成和微生物細胞表面酶展示技術(shù)等方面。近幾年，這種微生物在食品工業(yè)、醫(yī)藥、生物技術(shù)和化工等領(lǐng)域應用的研究不斷深入，在微膠囊、乳酸、苯乳酸、微生物細胞表面酶展示等方面的研究引起了業(yè)內(nèi)廣泛的重視，成為當前工業(yè)微生物和生物化工領(lǐng)域關(guān)注的前沿領(lǐng)域之一。

但是，當前報道的副干酪乳桿菌高產(chǎn)菌株仍然很少，其在高值有機酸發(fā)酵合成及細胞表面酶展示等新領(lǐng)域的應用剛剛起步，相關(guān)的機制和基礎(chǔ)研究十分有限，這些是下一步研究的重點方向。另外，隨著國內(nèi)外學者研究的逐步深入，副干酪乳桿菌發(fā)酵有機酸的產(chǎn)率和產(chǎn)物濃度將不斷提高，從發(fā)酵液中直接分離有機酸對于大規(guī)模生產(chǎn)應用至關(guān)重要。然而，目前對于其發(fā)酵產(chǎn)物中有機酸的分離則鮮有研究。因此，研究和篩選有機酸高產(chǎn)菌株、研究其細胞表面酶展示技術(shù)、探索副干酪乳桿菌發(fā)酵液中有機酸的分離技術(shù)等，都有深遠意義。