姚麗云，高 飛，林進妹，潘裕添

(閩南師范大學 菌物產(chǎn)業(yè)工程技術中心,福建 漳州 363000)

甲殼素是一種天然高分子聚合物，是N-乙酰-D-葡萄糖胺的聚糖，屬于直鏈氨基多糖。它也是一種不溶于水、稀堿、稀酸、濃堿及一般有機溶劑，但可以溶于濃HCl、H2SO4和H3PO4；且同時主鏈可被降解[1]，在濃H2SO4中可以充分水解成易溶于水而微溶于乙醇的白色晶體D-氨基葡萄糖硫酸鹽。

氨基葡萄糖類化合物是治療骨關節(jié)炎的特異性藥物[2]，在自然界中主要以氨基葡萄糖鹽酸鹽、氨基葡萄糖硫酸鹽和N-乙酰氨基葡萄糖的形式存在。但由于氨基葡萄糖鹽酸鹽中Cl-濃度高達17%，其細胞毒性相對較大，而氨基葡萄糖硫酸鹽由于極易吸潮不穩(wěn)定，因此，現(xiàn)市面上銷售的大多為氨基葡萄糖硫酸鹽的復鹽，主要是氨基葡萄糖硫酸鈉鹽、氨基葡萄糖硫酸鉀鹽。

氨基葡萄糖硫酸鹽具有生理活性，是人體關節(jié)軟骨基質和滑液中蛋白多糖的重要組成部分，可以刺激軟骨細胞產(chǎn)生生理性蛋白多糖，促進軟骨基質中膠原蛋白的合成，維護關節(jié)軟骨的形態(tài)結構[3]。

目前氨基葡萄糖硫酸鹽的制備工藝主要有3種：1)用高濃度鹽酸水解甲殼素制備氨基葡萄糖鹽酸鹽，再與硫酸鹽進行復配制備氨基葡萄糖硫酸鹽復鹽，但是得到的產(chǎn)品Cl-含量較高；2)使用反離子交換法制備氨基葡萄糖硫酸鹽，通過這種方法得到的氨基葡萄糖硫酸鹽不穩(wěn)定，難以大量生產(chǎn)；3)用H2SO4直接水解殼聚糖制備氨基葡萄糖硫酸鹽，得到的產(chǎn)品穩(wěn)定性較好。

本文中，筆者以H2SO4水解甲殼素制備氨基葡萄糖硫酸鹽，不僅克服了氨基葡萄糖硫酸鹽不穩(wěn)定的特性，相對于氨基葡萄糖硫酸鉀鹽、氨基葡萄糖硫酸鈉鹽，用H2SO4水解甲殼素制備的氨基葡萄糖硫酸鹽中Cl-含量有望大大降低，可為其應用并開發(fā)治療關節(jié)炎的藥物提供更優(yōu)質的原料。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

殼聚糖，100%乙醇，98.08% H2SO4，國藥集團化學試劑有限公司；D-氨基葡萄糖硫酸鹽(GAH)，上海阿拉丁生化科技有限公司。

1.2 儀器設備

AUY120型電子天平，日本SHIMADZU GORPORATION有限公司；UV-100型紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；SHB-III 型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城工貿(mào)有限公司；JC101型電熱鼓風干燥箱，上海成順儀器有限公司；LG-0.2凍干機，新陽速凍設備制造有限公司；HH2-數(shù)顯恒溫水浴箱，金壇市科析儀器有限公司；RE-301恒溫水油浴鍋,旋轉蒸發(fā)器，鞏義市予華儀器有限責任公司；METTLER TOLEDO pH計，瑞士METTLER TOLEDO有限公司；Agilent HPLC 1260高效液相色譜儀(HPLC)，美國安捷倫上?？萍加邢薰荆籈SI離子源Agilent 6320 Ion Trap LC/MSD，美國安捷倫有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 D-氨基葡萄糖硫酸鹽提取工藝流程

準確稱取0.5 g殼聚糖粉末，按一定的物料比、溫度、H2SO4質量分數(shù)和時間冷凝回流提取，棄濾渣定容于100 mL容量瓶中，測定水解后樣品中葡萄糖胺的含量；各因素分別做3個平行實驗。

1.3.2 單因素實驗

分別考察酸解時間、酸解溫度、物料比及H2SO4質量分數(shù)對D-氨基葡萄糖硫酸鹽得率的影響。參照文獻[4]中的Elson-Morgan法,以D-氨基葡萄糖硫酸鹽(GAH)標準品，計算水解液中氨基葡萄糖硫酸的質量濃度，得到標準曲線(圖1)。

標準曲線計算式見式(1)，氨基葡萄糖溫度和產(chǎn)率的計算公式見式(2)和(3)。

(1)

(2)

(3)

圖1 GAH質量濃度與吸光度值的標準曲線Fig.1 The standard curue of GAH concentration and absorbance value

式中：ρ為測定用樣品液中氨基葡萄糖的質量濃度，μg/mL；y為吸光度；a為標準曲線的斜率；b為標準曲線的截距；X為樣品中氨基葡萄糖純度，%；ρ0為試劑空白液中氨基葡萄糖的質量濃度，μg/mL；f為樣液稀釋倍數(shù)；V為樣液定容體積，mL；m為試樣的質量，g。Z為氨基葡萄糖的產(chǎn)率，%；M為原料的質量，g。

1.3.3 響應面優(yōu)化實驗

根據(jù)單因素實驗結果，選擇酸解溫度、H2SO4質量分數(shù)、酸解時間和物料比進行四因素三水平優(yōu)化實驗。采用Design-Expert中的Box-Behnken設計響應面實驗對提取條件進行優(yōu)化。以D-氨基葡萄糖硫酸鹽得率(Y)為考察目標，H2SO4質量分數(shù)(A)、物料比(B)、溫度(C)和時間(D)為自變量，因素水平編碼見表1。

表1 Box-Behnken設計實驗因素水平及編碼

1.3.4 驗證實驗

根據(jù)所建立的二次項數(shù)學模型預測D-氨基葡萄糖硫酸鹽在最優(yōu)工藝參數(shù)下的得率，相同條件下測定D-氨基葡萄糖硫酸鹽的實際得率，驗證響應面的準確性。

1.3.5 響應面數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Design-Expert 8.0.6軟件分析響應面數(shù)據(jù)，得出最優(yōu)工藝參數(shù)。

1.3.6 HPLC-MS對酸解組分進行分析[5]

1)色譜條件 色譜柱為StableBond C18分析柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)；流動相為H3PO4緩沖溶液和乙腈以60∶ 40的體積比混合；流速為0.6 mL/min；檢測波長為195 nm；色譜柱柱溫30 ℃；進樣量20 μL。

2)溶液的配制 ①標準品儲備液的配制：精確稱取D-氨基葡萄糖硫酸鹽標準品110 mg，用去離子水溶解后定容于100 mL容量瓶中，得1.1 mg/mL標準儲備液,取待測溶液1 mL經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，注入高效液相色譜分析。②實驗樣品溶液的配制：精密稱取3份270 mg實驗樣品于100 mL容量瓶中，用去離子水溶解后定容于100 mL容量瓶中，搖勻。取待測溶液1 mL經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，注入高效液相色譜分析。③H3PO4緩沖液的配制：將0.5 mL H3PO4溶于水后加水至1 L(用 KOH 溶液調至pH 3.0)，搖勻后用超聲波處理15 min，經(jīng) 0.45 μm濾膜過濾。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 H2SO4質量分數(shù)對D-氨基葡萄糖硫酸鹽得率的影響

當酸解溫度90 ℃，物料比(mL/g)為6∶ 1以及酸解時間4 h時，H2SO4質量分數(shù)對D-氨基葡萄糖硫酸鹽得率的影響見圖1。由圖1可知：D-氨基葡萄糖硫酸鹽得率隨著H2SO4質量分數(shù)的升高出現(xiàn)先升高后下降的趨勢，當H2SO4質量分數(shù)為60%時，D-氨基葡萄糖硫酸鹽得率最高。而H2SO4質量分數(shù)過高可能引起D-氨基葡萄糖硫酸鹽降解炭化。因此選擇H2SO4質量分數(shù)為60%為宜。

圖1 H2SO4質量分數(shù)對D-氨基葡萄糖 硫酸鹽得率的影響曲線 Fig.1 Effect of sulphuric acid concentration on the yield of D-glucsosamine sulfate

2.1.2 物料比對D-氨基葡萄糖硫酸鹽得率的影響

當酸解溫度90 ℃、H2SO4質量分數(shù)60%以及酸解時間4 h時，物料比對D-氨基葡萄糖硫酸鹽得率的影響見圖2。由圖2可知：D-氨基葡萄糖硫酸鹽得率隨著物料比的升高出現(xiàn)先升高后下降的趨勢，當物料比(mL/g)為6∶ 1時，D-氨基葡萄糖硫酸鹽得率最高。因此，選擇物料比(mL/g)6∶ 1為宜。

2.1.3 酸解溫度對D-氨基葡萄糖硫酸鹽得率的影響

當物料比(mL/g)為6∶ 1、H2SO4質量分數(shù)60%以及酸解時間4 h時，酸解溫度對D-氨基葡萄糖硫酸鹽得率的影響見圖3。由圖3可知：D-氨基葡萄糖硫酸鹽得率隨著酸解溫度的升高出現(xiàn)先升高后下降的趨勢；當溫度為90 ℃時D-氨基葡萄糖硫酸鹽得率最高。因此，選擇溫度90 ℃為宜。

圖2 物料比對D-氨基葡萄糖硫酸鹽得率的影響曲線Fig.2 Effect of material ratio on the yield of D-glucosamine sulfate

圖3 酸解溫度對D-氨基葡萄糖硫酸鹽得率的影響曲線Fig.3 Effect of acid hydrolysis temperature on the yield of D-glucosamine sulfate

2.1.4 酸解時間對D-氨基葡萄糖硫酸鹽得率的影響

當物料比(mL/g)為6∶ 1、H2SO4質量分數(shù)60%以

及酸解溫度90 ℃時，酸解時間對D-氨基葡萄糖硫酸鹽得率的影響見圖4。由圖4可知：D-氨基葡萄糖硫酸鹽得率呈隨著酸解時間的延長出現(xiàn)先升高后下降的趨勢，當酸解時間為4 h時，D-氨基葡萄糖硫酸鹽得率最高，因此選擇酸解時間4 h為宜。

圖4 酸解時間對D-氨基葡萄糖硫酸鹽得率的影響曲線Fig.4 Effect of acid hydrolysis time on the yield of D-glucosamine sulfate

2.2 響應面法對酸解殼聚糖工藝的優(yōu)化

2.2.1 響應面設計試驗

參照文獻[6]的方法，根據(jù)單因素得出的最優(yōu)條件，以H2SO4質量分數(shù)、物料比、溫度和時間為決策變量，以D-氨基葡萄糖硫酸鹽得率為目標函數(shù)，應用Box-Behnken設計響應面試驗，試驗設計及結果見表2。由于單因素得到的最佳溫度為90 ℃，在設計響應面時為了使溫度與其他3個因素相互影響的曲面圖更為顯著，故選擇以85 ℃為中間點，70 ℃為下限，100 ℃為上限溫度。

表2 Box-Behnken試驗設計及結果

2.2.2 回歸模型的方差分析和顯著性檢驗

回歸模型、各項的方差分析和參數(shù)估計及顯著性分析的結果見表3。

表3 回歸模型的方差分析及顯著性檢驗

以D-氨基葡萄糖硫酸鹽得率Y為目標函數(shù)，得到二次多項回歸方程為Y=39.93-2.42A-0.31B+4.05C+2.53D-3.06AB-15.30AC-9.10AD-2.00BC-1.00BD-9.21CD-11.16A2-5.49B2-11.41C2-1.89D2?；貧w方程F值為83.8，P<0.001，失擬值為5.16，相應的概率P值為0.063 9，大于0.05，顯示該模型不失擬，即表示上述回歸模型可信，F(xiàn)值越大，說明該因素對D-氨基葡萄糖硫酸鹽得率影響越大。由表3可以看出：影響D-氨基葡萄糖硫酸鹽得率的因素主次順序為溫度、時間、H2SO4質量分數(shù)、物料比，一次項C項偏回歸系數(shù)極顯著，A、D兩項偏回歸系數(shù)較顯著，B項偏回歸系數(shù)不顯著。說明溫度、時間和H2SO4質量分數(shù)對D-氨基葡萄糖硫酸鹽得率影響較大，物料比的影響較小，交互項只有AC、AD、CD有顯著性，二次項中 A2、B2和C2的偏回歸系數(shù)達極顯著，表明影響因素對D-氨基葡萄糖硫酸鹽得率并非呈簡單的線性關系。

由圖5～10可以看出：響應面均開口向下，都從最高點向四周邊緣逐漸下降，圖7曲面最陡、等值線最高，即H2SO4質量分數(shù)與溫度2個因素的交互影響最大，圖6、圖10曲面較陡，等值線均是扁的，表明時間與H2SO4質量分數(shù)、溫度這2個因素的交互影響較大。圖5與圖8曲面較平，等值線都較圓，表明物料比與酸解時間、溫度這2個因素的交互影響較小。結合回歸模型，由Design-Expert對回歸方程進行分析可得出：提取D-氨基葡萄糖硫酸鹽的最佳工藝為H2SO4質量分數(shù)53.29%、物料比(mL/g)為6∶ 1、溫度88.31 ℃和時間6 h，理論得率為43.86%。為了驗證回歸模型的有效性，用響應面的最優(yōu)條件水解蝦蟹殼殼聚糖30 g，測定氨基葡萄糖含量，換算成D-氨基葡萄糖硫酸鹽得率，重復3次實驗，得到的實際產(chǎn)率為42.69%，與理論值并無顯著差異，由此證明實驗模型合理。

2.3 HPLC-MS對H2SO4水解殼聚糖產(chǎn)物組分的分析

D-氨基葡萄糖硫酸鹽標準品質譜圖如圖12(a)所示，低質譜區(qū)出現(xiàn)離子豐度較大的質荷比(m/z)=162.0,推測為D-氨基葡萄糖硫酸鹽(GHS)失去1個NH2H2SO4的[M- NH2H2SO4]碎片離子，m/z=180推測為GHS失去1個H2SO4再加上1個H+的[M- H2SO4+H+],m/z=201.9推測為GHS失去1個NH2H2SO4再加上1個K+的[M- NH2H2SO4+K+]碎片離子，結果與文獻[7]對GHS分子質量的記載一致。

圖5 酸解時間與物料比對D-氨基葡萄糖硫酸鹽 得率影響的響應面曲線Fig.5 Response surface plot of time and the ratio of liquid to solid to the yeild

圖6 H2SO4質量分數(shù)與時間對D-氨基葡萄糖 硫酸鹽得率影響的響應面曲線Fig.6 Response surface plot of sulphuric acid concentration and time to the yield

圖7 H2SO4質量分數(shù)與溫度對D-氨基葡萄糖 硫酸鹽得率影響的響應面曲線Fig.7 Response surface plot of sulphuric acid concentration and temperature to the yield

圖8 物料比與溫度對D-氨基葡萄糖 硫酸鹽得率影響的響應面曲線Fig.8 Response surface plot of the ratio of liquid to solid and temperature to the yield

圖9 H2SO4質量分數(shù)與物料比對D-氨基葡萄糖 硫酸鹽得率影響的響應面曲線Fig.9 Response surface plot of ratio of the liquid to solid and sulphuric acid concentration to the yield

圖10 時間與溫度對D-氨基葡萄糖 硫酸鹽得率影響的響應面曲線Fig.10 Response surface plot of time and temperature to the yield

H2SO4水解殼聚糖制備的D-氨基葡萄糖硫酸鹽樣品m/z譜圖如圖12(b)所示。低質譜區(qū)出現(xiàn)離子豐度較大的m/z=162.0推測為GHS失去1個NH2H2SO4的[M- NH2H2SO4]碎片離子，m/z=180推測為GHS失去1個H2SO4再加上1個H+的[M- H2SO4+H+],m/z=202.1推測為GHS失去1個NH2H2SO4再加上1個K+的[M- NH2H2SO4+K+]碎片離子，m/z=321.1推測為葡萄糖胺二聚糖硫酸鹽失去1個NH2H2SO4的碎片離子。

故綜合圖11和12液相譜圖與質譜圖推測：H2SO4水解殼聚糖的產(chǎn)物為D-氨基葡萄糖硫酸鹽、葡萄糖胺和葡萄糖胺二聚糖硫酸鹽混合物。

注：(a)對照品溶液為HPLC-UV在195 nm的色譜圖圖11 對照品溶液和樣品溶液的 HPLC-UV譜圖Fig.11 HPLC-UV chromatograms of refence substance CK and sample

圖12 對照品溶液和樣品溶液的一級質譜圖Fig.12 MS and MS/MS spectra of CK and sample

3 結論

通過響應面法得出提取D-氨基葡萄糖硫酸鹽的最佳工藝：H2SO4質量分數(shù)53.29%，物料比(mL/g)為6∶ 1，溫度88.31 ℃ 和時間6 h，得到理論產(chǎn)率43.86%。水解產(chǎn)物為D-氨基葡萄糖硫酸鹽、葡萄糖胺和葡萄糖胺二聚糖硫酸鹽混合物。該混合物穩(wěn)定性較好，克服了氨基葡萄糖硫酸鹽不穩(wěn)定的特性，為其進一步被應用于開發(fā)治療關節(jié)炎的用藥提供了依據(jù)。