侍江春，肖宇雪，俸貴強，蔡甜，陳科偉*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715) 2(食品科學與工程國家級實驗教學示范中心(西南大學)，重慶，400715)3(西南大學 化學化工學院，重慶，400715)

紫菜隸屬于紅藻門、原紅藻綱、紅毛菜目、紅毛菜科、紫菜屬藻類，條斑紫菜(Pyropiayezoensis)和壇紫菜(Pyropiahaitnensis)是主要的養(yǎng)殖種類[1]。紫菜是東亞(中國、日本、韓國)主要經(jīng)濟海藻之一[2-3]，中國是主要的紫菜生產(chǎn)國，其中江蘇省為條斑紫菜主要生產(chǎn)區(qū)[1, 4-5]。紫菜富含蛋白質、多糖、纖維素、礦物質和維生素等多種營養(yǎng)成分和生物活性物質[6-8]，含有25%～50%(質量分數(shù)，干重)的蛋白質和25%～40%的碳水化合物[2, 9]。市售干條斑紫菜是一種高蛋白、低脂肪、富含膳食纖維和多種礦物質的天然食品[10]，干條斑紫菜經(jīng)烤制即為烤條斑紫菜或海苔，深受消費者喜愛[11]。

色澤是評價條斑紫菜商業(yè)價值的重要指標。條斑紫菜中含有豐富的光合色素，主要包括藻膽蛋白和葉綠素[12]。藻膽蛋白是一種高效捕光色素蛋白，由脫輔基蛋白和幾種藻膽素特異性結合而成，存在于藍藻、隱藻、紅藻及少數(shù)甲藻中[13]。根據(jù)波長吸收性質不同可分為藻紅蛋白、藻藍蛋白、藻紅藍蛋白和別藻藍蛋白[14-15]。藻膽蛋白具有抗氧化性、抗炎和抗癌能力[16]，作為天然色素廣泛應用于食品、化妝品、紡織品等領域，作為功能因子應用于保健品、藥品、抗氧化劑和抗炎藥物試劑，因較強的熒光特性和較寬的吸收光譜作為熒光探針和光敏劑應用于生物醫(yī)學領域[10, 16-18]，具有較高的生物利用價值。

葉綠素為鎂卟啉化合物[19]，普遍存在于高等綠色植物、原核的藍藻菌和真核的藻類中[20-22]，具有抗菌、消炎、護肝、防臭、抗氧化、抗誘變等功能[21-22]，尤其在功能性食品、醫(yī)藥、化妝品方面有良好的開發(fā)前景。

目前尚未有文獻報道建立干條斑紫菜和烤條斑紫菜顏色與儀器分析相關聯(lián)的質量評價體系，我國對干條斑紫菜分級參照GB/T 23597—2009標準執(zhí)行，紫菜的色澤指標僅憑肉眼觀測。為此本研究通過實驗分析紫菜中的藻膽蛋白和葉綠素的含量和組成，用色差儀客觀量化干條斑紫菜和烤條斑紫菜外觀顏色，并與光合色素含量進行相關性分析和逐步回歸分析，建立色澤指標同光合色素間的量效關系，以期為商業(yè)紫菜產(chǎn)品的質量評價提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

不同等級干條斑紫菜(AAA、A、B、C、D、E級)，萬紫匯紫菜交易平臺，所有紫菜均為江蘇省連云港生產(chǎn)，紫菜分級嚴格按照萬紫匯專業(yè)平臺定級?？緱l斑紫菜以AAA級干條斑紫菜為原料，分別在180 ℃烤制30～50 s，參考js/zcxh 001—2014《條斑紫菜 干紫菜等級標準》定級為1～5級。液氮，重慶沙坪壩區(qū)雙流液氮經(jīng)營部；N,N-二甲基甲酰胺(N,N’-dimethylformamide, DMF)、MgCO3、醋酸銨、NaH2PO4和Na2HPO4(均為分析純)、甲醇和丙酮(均為色譜純)，重慶市鈦新化工有限公司；葉綠素a標準品，日本wako試劑公司；葉綠素a衍生物標準品，實驗室自制[23]。

1.2 主要儀器及設備

UltraScan PRO分光測色儀，美國Hunter Lab公司；Depelec TE55ACS嵌入式蒸烤一體機，德普凱信(浙江)有限公司；SPEX SamplePrep Geno高通量冷凍研磨機，上海德可納利儀器有限公司；SQP電子天平，賽多利斯(北京)科學儀器有限公司；KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；磁力攪拌器，上海齊欣科學儀器有限公司；Centrifuge 5810離心機，艾本德(上海)國際貿(mào)易有限公司進口；UV-1240紫外分光光度計、LC-20A高效液相色譜儀(含二極管陣列檢測器)，日本島津公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理

不同等級干條斑紫菜和烤條斑紫菜在液氮保護下，用高通量冷凍研磨機研磨成粉，過80目篩，-23 ℃密封保藏備用。

1.3.2 顏色測定

采用色差儀對過80目篩的不同等級干條斑紫菜、烤條斑紫菜進行顏色測定，得到客觀量化顏色指標值L*、a*、b*、c*、h*，其中L*為明亮度，L*值越大，明度越大，感覺越白；a*為紅綠色度，正值為紅方向，負值為綠方向；b*為黃藍色度，正值為黃方向，負值為藍方向；c*和h*分別為色澤飽和度和色調角，分別按公式(1)(2)計算：

(1)

(2)

1.3.3 光合色素含量測定

1.3.3.1 藻膽蛋白含量測定

藻膽蛋白的提?。簠⒖嘉墨I[24]的方法，準確稱取200 mg條斑紫菜粉于50 mL離心管中，加入40 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 6.5)，700 W超聲處理5 min后，4 ℃磁力攪拌提取2 h，5 000 r/min離心5 min，取上清液測量。

藻膽蛋白含量的測定：吸取樣品上清液，分別測定其在562、615、652 nm波長處的吸光值。藻膽蛋白含量按公式(3)(4)(5)計算：

(3)

(4)

(5)

式中：ρ(P)，藻藍蛋白的含量，mg/mL；ρ(AP)，別藻藍蛋白的含量，mg/mL；ρ(PE)，指藻紅蛋白的含量，mg/mL。

1.3.3.2 葉綠素含量測定

葉綠素的提取和測定采用高效液相色譜進行分析[25-26]。DMF用過濾后飽和MgCO3溶液配成90% DMF水溶液，用于提取條斑紫菜中葉綠素。準確稱取200 mg條斑紫菜粉于50 mL離心管中，加入40 mL提取液，700 W超聲處理5 min后，4 ℃提取過夜，0.22 μm過濾后即可用于高效液相色譜分析。

采用梯度洗脫程序,流動相A∶V(甲醇)∶V(1 mol/L醋酸銨溶液)∶V(水)=8∶1∶1；流動相B∶V(甲醇)∶V(丙酮)=1∶1。流速為1 mL/min，流動相B起始體積分數(shù)25%，35 min內(nèi)，流動相B 線性變化至100%，并保持15 min。采用二極管陣列檢測器檢測(350～700 nm)，根據(jù)標準品和色譜峰吸光性質定性定量分析葉綠素a及其衍生物。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

條斑紫菜顏色測定重復20次，結果表示為平均值±標準差。其余試驗均重復3次，采用Microsoft Excel 2010和SPSS 18.0進行顯著性差異分析、Pearson相關分析、逐步回歸方程分析(不同字母表示P<0.05的顯著性差異)，Origin 8.1軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 條斑紫菜顏色分析

由圖1可知，不同級別干條斑紫菜和烤條斑紫菜組間組內(nèi)L*、a*、b*、c*、h*值差異顯著(P<0.05)。各顏色指標值差異最大的是a*值和h*值，干條斑紫菜為正值，烤條斑紫菜為負值，表明干條斑紫菜偏紅而烤條斑紫菜偏綠?？緱l斑紫菜相比于干條斑紫菜L*、b*值更大，表明烤條斑紫菜比干條斑紫菜更白、更黃。黃林彬等[27]研究發(fā)現(xiàn)，高溫可導致條斑紫菜葉狀體顏色不同程度加深，說明烤制對條斑紫菜的外觀顏色產(chǎn)生一定影響，使烤條斑紫菜相較于干條斑紫菜呈現(xiàn)明亮的黃綠色。不同級別干條斑紫菜和烤條斑紫菜L*、a*、b*、c*值均呈現(xiàn)“波動狀”，ARUGA[28]發(fā)現(xiàn)，紫菜品質的好壞主要取決于葉狀體的3種主要光合色素(綠色的葉綠素a、藍色的藻藍蛋白和紅色的藻紅蛋白)含量的高低，且與它們之間的比例相關，所以無法用單一色度值表征干條斑紫菜和烤條斑紫菜等級。

a-不同種類條斑紫菜L*值對比圖;b-不同種類條斑紫菜a*值對比圖;c-不同種類條斑紫菜b*值對比圖;d-不同種類條斑紫菜c*值對比圖;e-不同種類條斑紫菜h*對比圖圖1 條斑紫菜各顏色指標值Fig.1 Color indexes of Porphyra yezoensis

2.2 光合色素含量分析

葉綠素和藻膽蛋白色素是條斑紫菜中主要的光合色素[12]。由表1可知，干條斑紫菜光合色素含量大小依次為藻藍蛋白、藻紅蛋白、別藻藍蛋白和葉綠素a，烤條斑紫菜光合色素含量大小依次為藻藍蛋白、別藻藍蛋白、藻紅蛋白和葉綠素a。不同級別干條斑紫菜別藻藍蛋白含量差異不顯著，變異系數(shù)最低為14.97%。其余各光合色素含量和總藻膽蛋白含量、總葉綠素、總光合色素含量差異極顯著(P<0.01)，變異系數(shù)均在15%以上。藻藍蛋白、藻紅蛋白、葉綠素a分別為16 202.78～30 706.41、18 370.28～30 528.13和1 330.64～2 846.16 mg/kg。經(jīng)過烤制以后，烤條斑紫菜中藻藍蛋白、藻紅蛋白、別藻藍蛋白、葉綠素 a、脫植基葉綠素a、總藻膽蛋白、總葉綠素、總光合色素含量均減少，其藻藍蛋白、藻紅蛋白、葉綠素 a含量為干條斑紫菜的1/5～1/6。高溫操作影響光合色素的穩(wěn)定性，俞麗燕[29]、CHAIKLAHAN等[30]研究發(fā)現(xiàn)，藻藍蛋白的穩(wěn)定性易受溫度、pH、光照強度、離子濃度等的影響，高溫也能造成葉綠素 a的降解，使其含量降低[31]。另外程超等[32]在研究葛仙米藻膽蛋白與色度降解動力學時發(fā)現(xiàn)，葛仙米藻藍蛋白色素溶液在高溫處理時會有明顯的褪色現(xiàn)象，并且溫度越高褪色越明顯。經(jīng)過烤制后，紫菜中大量藻膽蛋白分解，葉綠素比例增加，從而顯現(xiàn)出綠色或黃綠色[33]，與圖1結果相一致?？緱l斑紫菜中，葉綠素衍生物含量明顯增多，如C132-OH 葉綠素a、脫鎂葉綠素a、焦脫鎂葉綠素a、phytyl-purpurin a，表明葉綠素在期間也發(fā)生了脫鎂和氧化反應。烤條斑紫菜各光合色素含量變異系數(shù)均在20%以上，脫植基葉綠素a、葉綠素a甚至達到50%以上，說明經(jīng)過烤制之后，會增大條斑紫菜之間光合色素含量的差異。

2.3 條斑紫菜顏色與光合色素含量的相關分析

對6種干條斑紫菜和5種烤條斑紫菜各光合色素含量與顏色指標進行相關分析，然后進一步對干條斑紫菜和烤條斑紫菜各光合色素含量與顏色指標進行逐步回歸分析。

2.3.1 干條斑紫菜各光合色素含量之間的相關分析

干條斑紫菜各光合色素含量間相關性結果見表2。光合色素含量中總光合色素含量與其他光合色素含量均呈正相關，與藻藍蛋白、藻紅蛋白、別藻藍蛋白、脫植基葉綠素a、葉綠素 a、總藻膽蛋白、總葉綠素含量顯著正相關(r=0.604～1.000)，與C132-OH 葉綠素a、脫鎂葉綠素a、焦脫鎂葉綠素a含量正相關，但相關性不顯著(r=0.196～0.202)；總藻膽蛋白與藻藍蛋白、藻紅蛋白、別藻藍蛋白、脫植基葉綠素a、葉綠素 a含量顯著正相關(r=0.551～0.995)；總葉綠素與藻藍蛋白、藻紅蛋白、脫植基葉綠素a、葉綠素 a含量極顯著正相關(r=0.718～1.000)；C132-OH 葉綠素a、脫鎂葉綠素a、焦脫鎂葉綠素a含量之間極顯著正相關(r=0.805～1.000)?？傇迥懙鞍住⒖側~綠素、總光合色素含量與藻藍蛋白、藻紅蛋白、葉綠素a之間相關性極強，均在0.900以上(P<0.01)，可見各光合色素含量之間都存在著不同程度的相關性。

2.3.2 烤條斑紫菜各光合色素含量之間的相關分析

烤條斑紫菜各光合色素含量間相關性結果見表3?？偣夂仙睾颗c藻藍蛋白、藻紅蛋白、別藻藍蛋白、脫植基葉綠素a、葉綠素a、總藻膽蛋白、總葉綠素含量顯著正相關(r=0.651～0.994)，與C132-OH 葉綠素a、脫鎂葉綠素a、phytyl-purpurin a含量呈負相關，其中與phytyl-purpurin a含量相關性最強，相關系數(shù)為-0.773(P<0.01)。藻藍蛋白、藻紅蛋白與脫植基葉綠素a、葉綠素 a、總藻膽蛋白、總葉綠素、總光合色素含量均呈正相關,與干條斑紫菜相比，相關系數(shù)均下降，而別藻藍蛋白與其相關系數(shù)卻上升，可能由于烤制之后烤條斑紫菜藻藍蛋白和藻紅蛋白含量成倍地減少，而別藻藍蛋白只減少至干條斑紫菜的一半，從而導致相關系數(shù)上升。盡管如此，除了藻紅蛋白與總葉綠素相關性不強外(r=0.273)，烤條斑紫菜總藻膽蛋白、總葉綠素、總光合色素含量和藻藍蛋白、藻紅蛋白、葉綠素 a含量極顯著相關(r=0.602～0.962)，說明藻藍蛋白、藻紅蛋白、葉綠素a依然是烤條斑紫菜3種重要的光合色素。

2.3.3 條斑紫菜各光合色素含量與顏色指標的相關分析

條斑紫菜各光合色素含量與顏色指標相關性結果見表4?？緱l斑紫菜phytyl-purpurin a含量與b*、c*值顯著正相關(r=0.914，0.906)，說明b*、c*值越大，烤條斑紫菜phytyl-purpurin a含量越多。其余條斑紫菜各光合色素含量與顏色指標值相關性不顯著(P<0.05)。但可看出干條斑紫菜a*值與各光合色素含量呈負相關(r=-0.493～-0.185)，c*值和h*值與各光合色素含量呈正相關(r=0.062～0.390，r=0.033～0.714)，表明a*值越小、c*值和h*值越大，干條斑紫菜各光合色素含量越多。干條斑紫菜總藻膽蛋白、總葉綠素、總光合色素含量與L*、a*值呈負相關，與b*、c*值和h*值呈正相關，而烤條斑紫菜總藻膽蛋白、總葉綠素、總光合色素含量與L*、a*、b*和c*值呈負相關，與h*值呈正相關，可能因為烤制之后烤條斑紫菜呈黃綠色，藻藍蛋白含量成倍減少，使其與b*值的相關性增強。綜合分析，干條斑紫菜和烤條斑紫菜L*、a*值越小，h*值越大，總藻膽蛋白、總葉綠素和總光合色素含量越多。

表2 不同級別干條斑紫菜光合色素含量之間的相關性Table 2 Correlation of photosynthetic pigment content in different grades of dried laver

表3 不同級別烤條斑紫菜光合色素含量之間的相關性Table 3 Correlation of photosynthetic pigment content in different grades of roasted laver

表4 色度值與光合色素含量之間的相關性Table 4 Correlation between chroma value and photosynthetic pigment content

2.3.4 條斑紫菜各光合色素含量與顏色指標的回歸分析

根據(jù)干條斑紫菜、烤條斑紫菜各光合色素含量與其顏色指標的相關性分析可知，各光合色素含量與顏色指標值存在一定的關系。為了進一步了解各光合色素含量與顏色指標值間的關系，以各光合色素含量為因變量(Y)，顏色指標值為自變量(X)，進行逐步多元線性回歸分析。

如表5所示，通過逐步回歸分析后，模型中各光合色素含量預測值與實際值的相關系數(shù)與表4中每種光合色素含量與顏色指標值單獨的相關系數(shù)相比，均有不同程度的提高。這說明經(jīng)逐步回歸分析舍去相關性差的指標后，可提高光合色素含量預測模型的準確性。單自變量的預測模型沒有提高相關系數(shù)。干條斑紫菜別藻藍蛋白含量預測值與實際值的相關系數(shù)較低，可能因為別藻藍蛋白僅與單一顏色指標存在相關性且相關系數(shù)較低。

表5 條斑紫菜各光合色素含量與顏色指標回歸分析Table 5 Regression analysis of photosynthetic pigment content and color index of P.yezoensis

干條斑紫菜L*值(X1)和h*值(X5)可以很好的預測焦脫鎂葉綠素a含量(Y8)，其回歸方程如表5所示，所建立的模型在99.9%的程度上，可以通過L*值和h*值反映干條斑紫菜中焦脫鎂葉綠素a含量?？緱l斑紫菜L*(X1)、a*(X2)和b*值(X3)可以很好的預測藻藍蛋白(Y1)和總藻膽蛋白含量(Y10)，所建立的模型對其解釋概率都為100%，擬合程度非常完美?？緱l斑紫菜L*值(X1)和h*值(X5)可以很好的預測別藻藍蛋白含量(Y3)，b*(X3)、c*(X4)、h*值(X5)可以很好的預測phytyl-purpurin a含量(Y9)，所建立的模型對其解釋概率分別為95%和100%(P<0.05)。由上可知，干條斑紫菜的焦脫鎂葉綠素a含量和烤條斑紫菜藻藍蛋白、別藻藍蛋白、phytyl-purpurin a、總藻膽蛋白含量可以通過顏色值反映，而總光合色素以及條斑紫菜中3種主要的光合色素(藻藍蛋白、藻紅蛋白、葉綠素a)與顏色值建立的模型沒有顯著意義。為了進一步探究總光合色素含量和藻藍蛋白、藻紅蛋白、葉綠素a含量間的關系，以總光合色素含量為因變量(y)，藻藍蛋白(x1)、藻紅蛋白(x2)、葉綠素a含量(x3)為自變量，進行逐步多元回歸分析。干條斑紫菜總光合色素含量y1=10 445.04+1.96x1(R2=0.992，P=0.000)，烤條斑紫菜總光合色素含量y2=1 429.94+2.5x1(R2=0.971，P=0.002)，說明干條斑紫菜和烤條斑紫菜藻藍蛋白含量可以很好地預測總光合色素含量，為快速估計條斑紫菜中總光合色素含量提供參考。

3 結論

條斑紫菜色澤是紫菜光合色素含量和品質優(yōu)劣的“指示劑”，且條斑紫菜光合色素在人體內(nèi)具有重要的保健功能[34]。本文通過對6種干條斑紫菜和5種烤條斑紫菜進行光合色素含量及顏色測定，通過干條斑紫菜和烤條斑紫菜光合色素含量與顏色指標的相關性分析，可以得出以下結論：干條斑紫菜光合色素含量大小依次為藻藍蛋白、藻紅蛋白、別藻藍蛋白和葉綠素a，烤條斑紫菜光合色素含量大小依次為藻藍蛋白、別藻藍蛋白、藻紅蛋白和葉綠素 a。經(jīng)過烤制之后的藻藍蛋白、藻紅蛋白、葉綠素a含量為干條斑紫菜的1/5～1/6。干條斑紫菜和烤條斑紫菜各光合色素含量之間均有不同程度的相關性(|r|=0.037～1.000，|r|=0.041～0.994)，光合色素含量與顏色指標存在相關性，但相關性不強(|r|=0.033～0.994，|r|=0.034～0.914)。進一步以逐步回歸分析建立各光合色素含量的預測模型可提高光合色素含量預測值與實際值間的相關性，從而提高顏色指標反映條斑紫菜品質的準確性。但顏色指標對預測干條斑紫菜焦脫鎂葉綠素a含量、烤條斑紫菜藻藍蛋白、別藻藍蛋白、phytyl-purpurin a和總藻膽蛋白含量較為顯著，對總光合色素含量及3種主要的光合色素含量不顯著。為此建立干條斑紫菜和烤條斑紫菜總光合色素含量與藻藍蛋白、藻紅蛋白、葉綠素 a含量的逐步多元回歸方程，結果表明藻藍蛋白含量可以很好的預測條斑紫菜總光合色素含量。