劉小平 朱小兵 吳 論

1.廣東省中山市石岐蘇華贊醫(yī)院麻醉科，廣東中山 528402；2.廣東省中山市中醫(yī)院麻醉科，廣東中山 528400

呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷是呼吸支持治療中機(jī)械通氣相關(guān)性并發(fā)癥之一，常見(jiàn)于重癥醫(yī)學(xué)中[1-2]。有關(guān)研究表明，呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷與過(guò)度牽拉肺泡導(dǎo)致肺血管內(nèi)皮細(xì)胞激活相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)到通路，引起炎性反應(yīng)有關(guān)[3-7]。有研究提示右美托咪定可以減輕呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷，機(jī)制可能與其可抑制炎性反應(yīng)相關(guān)[8-9]，但其抑制炎性反應(yīng)的具體信號(hào)通路尚不明確。另外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，提示右美托咪定腎保護(hù)作用可能與P13K/Akt信號(hào)通路有關(guān)[10]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α 是內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制的始動(dòng)因子和共同途徑，是P13K/Akt信號(hào)通路的下游因子[11]。評(píng)價(jià)磷脂酰肌醇3-激酶-絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶-缺氧誘導(dǎo)因子-1α信號(hào)通路在右美托咪定減輕大鼠呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷中的作用，探討其減輕VILI的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

成年雄性SD大鼠60只，體重300～350g。隨機(jī)將其分為4組（n=15）：對(duì)照組（C組）、機(jī)械通氣組（V組）、右美托咪定組（D組）和右美托咪定+LY294002組（DL組）。

1.2 模型制備

20%烏拉坦溶液麻醉后，股動(dòng)脈穿刺置管術(shù)，測(cè)動(dòng)脈壓，股靜脈輸注乳酸鈉林格氏液10mL/（kg·h）；氣管切開(kāi)氣管導(dǎo)管，機(jī)械通氣2.5h，C組保留大鼠自主呼吸，其余三組大潮氣量，高頻率通氣；D組于術(shù)前10min內(nèi)靜脈輸注完右美托咪定（批號(hào)：13040932，江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司）5μg/kg后，以2.5μg/（kg·h）的速率輸注至實(shí)驗(yàn)結(jié)束；PI3K抑制劑LY294002輸注方法參考文獻(xiàn)[5]，DL組給予右美托咪定前靜脈注射LY294002（批號(hào)：Y1503s，碧云天生物技術(shù)研究所）0.3mg/kg，輸注時(shí)間5min，其余注射等量生理鹽水。

1.3 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)

于機(jī)械通氣前（T0）、機(jī)械通氣結(jié)束時(shí)（T1）、機(jī)械通氣結(jié)束30min（T2）時(shí)血?dú)夥治龊?，記錄RI和OI；取左肺組織，勻漿后，采用雙抗體夾心ELISA法（Santa CmZ公司），檢測(cè)TNF-α、IL-6和IL-10的含量；取右肺中葉組織，稱(chēng)濕重（W），烘干，稱(chēng)干重（D），計(jì)算肺W/D比值。取右肺組織，甲醛固定24h，行石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察肺組織形態(tài)的改變。取右肺前葉，抽提蛋白，Westrern-blot方法檢測(cè)P-Akt和HIF-1α的表達(dá)，參考文獻(xiàn)[5]的方法采用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移至聚乙烯二氟膜，濾膜封閉，分別加入抗p-Akt一抗（Santa Cruz 公司，美國(guó)）和抗HIF-1α，4℃過(guò)夜，TBS洗膜后，過(guò)氧化物標(biāo)記的二抗，以β-actin為內(nèi)參。發(fā)光與顯色后，采用凝膠掃描成像系分析圖像，以灰度值與β-actin積分光密度指的比值反映P-Akt和 HIF-1α的表達(dá)[5]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所以數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，多組計(jì)量資料采用F檢驗(yàn)， 組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 呼吸指數(shù)及氧合情況比較

與C組比較，其余三組T1、T2時(shí)RI升高，OI降低；與V組比較，D組和DL組T1、T2時(shí)RI降低，OI升高；DL組RI較D組降低、OI增高。見(jiàn)表1～2。

表1 四組大鼠不同時(shí)點(diǎn)呼吸指數(shù)比較（±s，n=12）

表1 四組大鼠不同時(shí)點(diǎn)呼吸指數(shù)比較（±s，n=12）

注：與C組比較，aP＜0.05；與V組比較，bP＜0.05；與DL組比較，cP＜0.05

組別 T0 T1 T2 C組 0.30±0.08 0.27± 0.05 0.30±0.03 V組 0.29±0.07 4.60±0.20a 7.17±0.11a DL組 0.31±0.07 3.81±0.05ab 6.78±0.02ab D組 0.33±0.02 1.00±0.11abc 1.57±0.07abc F 0.25 2.95 7.58 P ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 t（V與DL比較） 1.32 4.74 10.2 t（V與D比較） 0.95 6.25 58.2 t（D與DL比較） 1.02 4.68 42.5 P ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05

表2 四組大鼠不同時(shí)點(diǎn)氧合情況比較（±s，n=12）

表2 四組大鼠不同時(shí)點(diǎn)氧合情況比較（±s，n=12）

注：與C組比較，aP＜0.05 ； 與V組比較，bP＜0.05 ；與DL組比較，cP＜0.05

組別 T0 T1 T2 C組 475±40 485±30 464±34 V組 476±38 237±28a 245±34a DL組 473±29 305±26ab 309±28ab D組 458±29 330±24abc 372±30abc F 0.27 2.75 2.70 P ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 t （V與DL比較） 0.06 3.87 4.87 t（V與D比較） 0.21 9.25 10.24 t（D與DL比較） 0.17 3.51 6.54 P ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.2 肺組織炎性因子比較

與C組比較，其余三組肺組織TNF-α、IL-6、IL-10含量及W/D比升高；與V組比較，D組和DL組肺組織TNF-α、IL-6 、IL-10含量升高，W/D比降低（P＜0.05）；DL組肺組織TNF-α、IL-6含量及W/D比降低、IL-10含量較D組高（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 四組大鼠肺組織IL-6、W/D、TNF-α、IL-10和HO-1比較 （±s，n=12）

表3 四組大鼠肺組織IL-6、W/D、TNF-α、IL-10和HO-1比較 （±s，n=12）

注：與C組比較， aP＜0.05；與V組比較， bP＜0.05；與DL組比較，cP＜0.05

組別 W/D TNF-α（pg/g） IL-6 （pg/g） IL-10 （pg/g） HO-1 C組 4.30±0.20 87.8±22.8 10.7±3.0 34.2±22.4 0.009±0.001 V組 6.22±0.47 184.0±22.5a 20.9±3.4a 93.9±11.2a 0.090±0.020a DL組 5.45±0.32 234.5±16.4ab 27.3±2.6ab 173.5±15.5ab 0.150±0.030ab D組 5.14±0.23 110.2±12.5abc 13.1±2.8 abc 240±12.3 abc 0.335±0.050 abc F 0.215 2.68 3.25 2.71 2.98 P＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 t（V與DL） 1.43 2.52 6.2 16.2 23.04 t（V與D） 1.55 3.58 6.5 30.3 32.5 t（D與DL） 1.10 5.68 11.2 12.3 20.2 P＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.3 P-Akt和HIF-1α表達(dá)比較

與C組比較，P-Akt表達(dá)下調(diào)和HIF-1α表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）；與V組比較， P-Akt和HIF-1α表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）。DL組肺組織較D組P-Akt和HIF-1α表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 四組大鼠肺組織P-Akt和HIF-1α表達(dá)水平

3 討論

呼吸機(jī)相關(guān)肺損傷在臨床上不不少見(jiàn)，尤其在重癥醫(yī)學(xué)監(jiān)護(hù)室情況多見(jiàn)。研究和探討減少這種損傷的方法和機(jī)制有一定的臨床價(jià)值。此前有報(bào)道稱(chēng)右美托咪啶可以減輕呼吸機(jī)相關(guān)肺損傷，但是它的相關(guān)可能機(jī)制并不清楚，有必要進(jìn)一步研究并明確它的機(jī)制。所以我們研究中參考文獻(xiàn)[12]成功建立呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷動(dòng)物模型。我們的結(jié)果也提示，機(jī)械通氣可以誘發(fā)了大鼠呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷。

過(guò)去公開(kāi)報(bào)道中提到TNF-α是一種急性肺損傷的啟動(dòng)因子，它通過(guò)誘導(dǎo)NO，內(nèi)皮素、氧自由基等的產(chǎn)生導(dǎo)致肺損傷[13]。我們研究中參照文獻(xiàn)[14]，結(jié)合人體動(dòng)物劑量換算公式，最終選擇右美托咪定的給藥為術(shù)前10min靜脈輸注右美托咪定5μg/kg，再2.5μg/（kg·h）的速度靜脈給藥。本研究結(jié)果表明，與DL組比較，D組肺組織TNF-α、IL-6含量及W/D比降低、IL-10含量升高，RI降低、OI升高，DL組損傷程度高于D組，但仍低于V組，提示右美托咪定可減輕大鼠呼吸機(jī)相關(guān)性所致肺損傷，LY294002可部分抑制右美托咪定的肺保護(hù)作用。

本研究結(jié)果表明，相對(duì)C組來(lái)看，V組肺組織p-Akt表達(dá)情況下調(diào)，此結(jié)果間接提示呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷有可能與PI3K/Akt信號(hào)通路參與有關(guān)系；相對(duì)于V組來(lái)比較，我們發(fā)現(xiàn)D組肺組織p-Akt表達(dá)情況上調(diào)。LY294002是PI3K的特異性抑制劑，它通過(guò)靶向抑制PI3K的催化亞基pll0，再則減少靶分子PDK和Akt的活化[15]。此次研究給予LY294002完，我們發(fā)現(xiàn)DL組肺組織p-Akt表達(dá)水平較D組低許多，間接告訴我們LY294002可以有效地抑制P13K/Akt信號(hào)通路，進(jìn)一步確認(rèn)右美托咪定減輕肺損傷和它抑制PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)系。

我們還發(fā)現(xiàn)，p-Akt與HIF-1α的變化趨勢(shì)一致，進(jìn)一步確認(rèn)HIF-1α的表達(dá)與PI3K/Akt信號(hào)通路有一定的關(guān)系，右美托瞇定的上述作用可能與PI3K-Akt-HIF- 1α信號(hào)通路有關(guān)。

另外我們也發(fā)現(xiàn)，同V組來(lái)看，DL組肺損傷較低，此結(jié)果間接提示PI3K-Akt-HIF-1α通路抑制劑并不能完全抵消右美托咪定的作用，這一有趣現(xiàn)象告訴我們，在PI3K-Akt-HIF-1α通路以外的有其他分子通道亦可能也參與了右美托咪定的肺保護(hù)作用。

通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)研究，我們可以得出這樣的結(jié)論：右美托咪定可能通過(guò)影響P13K-Akt-HIF-1α信號(hào)通路進(jìn)而減輕大鼠呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷。