李振華, 張 華△, 陳建麗, 徐 超, 謝林森, 張 藝, 張 倩
(1鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,河南 鄭州 450007;2鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院檢驗(yàn)科,河南 鄭州 450007)
甲型流感病毒H1N1 肺炎是由單股RNA 病毒引起的急性呼吸道傳播疾病,可通過(guò)飛沫、氣溶膠、接觸傳染,傳染性強(qiáng),感染后患者重癥轉(zhuǎn)歸不良的風(fēng)險(xiǎn)較高,部分患者惡化后造成呼吸窘迫或衰竭,危及生命[1],及時(shí)有效的干預(yù)對(duì)于患者至關(guān)重要。以往研究主要以西藥治療為主,奧司他韋作為其中一種西藥,由于廣泛使用,患者體內(nèi)往往產(chǎn)生了耐藥性,造成效果不佳[2],而中藥藥效持久且副作用小,為甲型流感病毒H1N1 肺炎提供了新的治療方向。疏風(fēng)解毒膠囊(Shufeng-Jiedu capsule,SFJDC)中有虎杖、連翹等多種中藥成分,對(duì)病原菌具有廣泛抑制作用[3-5],能夠減輕感染導(dǎo)致的局部炎癥,增強(qiáng)組織抵抗力和修復(fù)能力[6],但鮮有關(guān)于甲型流感病毒H1N1 肺炎的研究。微小RNA(microRNA,miR)-155 參與肺部損傷過(guò)程[7],可通過(guò)調(diào)控 Janus 激酶(Janus kinase,JAK)-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)通路介導(dǎo)炎癥反應(yīng),影響牙周炎發(fā)生[8]。本研究探討SFJDC對(duì)甲型流感病毒H1N1肺炎模型小鼠的影響,并初步探討其作用機(jī)制。
50 只 SPF 級(jí)雄性 BALB/c 小鼠,6~7 周齡,體重(20±2)g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2016-0006。在溫度(26±1)℃、濕度(55±5)%、12 h 光照12 h 黑暗環(huán)境中飼養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核并通過(guò)。甲型流感病毒鼠肺適應(yīng)株(A/FM/1/47-MA)由中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所提供。
SFJDC 由天津藥物研究所有限公司提供,每粒0.52 g,由虎杖、連翹、板藍(lán)根、馬鞭草、敗醬草、柴胡、蘆根和甘草組成,各藥材均符合2015 年版《中國(guó)藥典》相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。miR-155 siRNA及miR-155和U6引物由上海生工生物有限公司合成;蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);小鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒,抗 JAK1、p-JAK1、STAT1 和 p-STAT1抗體,羊抗兔Ⅱ抗,BCA蛋白試劑盒(Abcam);cDNA 第一條鏈合成試劑盒(上海佰易聚生物有限公司);2× SYBR qPCR Mix(北京莊盟國(guó)際生物有限公司);DAB 工作液(杭州浩克生物科技有限公司)。QuantStudio 3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(ABI);UVP Gel-Solo蛋白凝膠成像儀(Jenapharm)。
3.1 分組及建模 小鼠按隨機(jī)數(shù)字法分為對(duì)照組、模型組、低劑量SFJDC 組、高劑量SFJDC 組和SFJDC+miR-155 siRNA 組,每組10 只。除對(duì)照組外,其余各組參考文獻(xiàn)[9]將小鼠用乙醚輕度麻醉,以15×LD50流感病毒液鼻滴感染小鼠,每只0.035 mL,對(duì)照組鼻滴等體積蒸餾水。從感染當(dāng)天起,低、高劑量SFJDC 組分別灌胃0.1 和0.5 g/(kg·d)SFJDC[10],SFJDC+miR-155 siRNA 組灌胃0.5 g/(kg·d)SFJDC并尾靜脈注射miR-155 siRNA,對(duì)照組和模型組灌胃等體積蒸餾水,每天1次,連續(xù)5 d。
3.2 肺指數(shù)檢測(cè) 立即處死小鼠,迅速解剖摘取肺,生理鹽水清洗干凈,吸干表面水分,稱(chēng)重,參考文獻(xiàn)[11]檢測(cè)各組小鼠肺指數(shù)。肺指數(shù)=小鼠肺質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。
3.3 HE 檢測(cè)肺組織病理情況 部分肺組織置于4%多聚甲醛中固定,經(jīng)脫水、二甲苯透明后,石蠟包埋,切片機(jī)切片,切片厚度4 μm。切片經(jīng)染色,依次進(jìn)入二甲苯和乙醇中脫蠟,蘇木精染色、1%鹽酸乙醇分化、伊紅復(fù)染,二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片,顯微鏡下觀察肺組織情況。
3.4 ELISA 檢測(cè)肺組織中 TGF-β、IL-6 和 TNF-α 水平 部分肺組織添加蛋白裂解液,冰上勻漿并充分裂解20 min,11 180×g、4 ℃離心20 min,上清液為總蛋白。參考小鼠TGF-β、IL-6和TNF-α ELISA 試劑盒檢測(cè)肺組織中TGF-β、IL-6和TNF-α水平。
3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)肺組織中miR-155 水平 部分肺組織手術(shù)剪在冰上剪碎、添加Trizol冰上研磨,提取總RNA,cDNA 第一條鏈合成試劑盒合成cDNA,實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)肺組織中miR-155 水平。miR-155的上游引物序列為5'-CGGCGGTTAATGCTAATTGTGAT-3',下游引物序列為5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3';U6 的上游引物序列為5'-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3',下游引物序列為5'-AAATATGGAACGCTTCACGA-3'。20 μL 反應(yīng)體系:2 μL cDNA,10 μL 2×SYBR qPCR Mix,上、下游引物(均為 10 μmol/L)各 1 μL,6 μL ddH2O。反應(yīng)條件:94 ℃ 20 s;95 ℃ 10 s,60 ℃ 20 s,40個(gè)循環(huán)。2-ΔΔCt法計(jì)算miR-155相對(duì)表達(dá)水平。
3.6 蛋白免疫印跡檢測(cè)肺組織中JAK1、p-JAK1、STAT1 和p-STAT1 蛋白水平 部分肺組織手術(shù)剪剪碎,添加蛋白裂解液冰上研磨并裂解,11 180×g、4 ℃離心20 min,上清為總蛋白,BCA 蛋白試劑盒檢測(cè)蛋白濃度,20 μg 上樣量經(jīng)凝膠電泳分離蛋白,硝酸纖維素膜280 mA轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,對(duì)應(yīng)加入 JAK1、p-JAK1、STAT1、p-STAT1 和 GAPDH 抗體,4 ℃孵育過(guò)夜;加入對(duì)應(yīng)Ⅱ抗,室溫孵育1 h。DAB 工作液避光顯色,蛋白凝膠成像儀拍照和灰度分析。
采用GraphPad Prism 7 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間比較行單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較行SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
與對(duì)照組相比,模型組肺指數(shù)顯著升高(P<0.05);與模型組相比,低、高劑量SFJDC 組肺指數(shù)顯著降低(P<0.05);與SFJDC 低劑量組相比,SFJDC 高劑量組肺指數(shù)顯著降低(P<0.05);與SFJDC 高劑量組相比,SFJDC+miR-155 siRNA 組肺指數(shù)顯著升高(P<0.05),見(jiàn)圖1。
Figure 1. Comparison of lung index in the 5 groups. Mean±SD.n=10.*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs model group;△P<0.05 vs low-dose SFJDC group;▲P<0.05 vs high-dose SFJDC group.圖1 5組肺指數(shù)水平比較
對(duì)照組小鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)完整、清晰,間質(zhì)間無(wú)充血、壞死、炎癥浸潤(rùn)等病理現(xiàn)象;模型組小鼠肺結(jié)構(gòu)消失,肺泡出現(xiàn)明顯斷裂、融合、滲出,肺間質(zhì)出現(xiàn)明顯炎癥浸潤(rùn)、水腫、充血現(xiàn)象;隨著SFJDC 劑量的升高,肺泡斷裂現(xiàn)象減少,肺泡融合及肺間質(zhì)炎癥浸潤(rùn)現(xiàn)象減輕,組織水腫緩解;在高劑量SFJDC 基礎(chǔ)上使用miR-155 siRNA 后,大鼠肺組織病變較SFJDC高劑量組加重,見(jiàn)圖2。
Figure 2. Morphological changes of lung tissues of the mice in the 5 groups. The scale bar=50 μm. Control group:the structure was complete without pathological phenomenon;model group:lungs showed destruction of the structure,and the arrow showed generous phenomenon of inflammatory infiltration and congestion;low-dose SFJDC group:alveolus pulmonis appeared,and arrow showed that phenomena of inflammatory infiltration and congestion were reduced;high-dose SFJDC group:the phenomenon of alveolar rupture was basically disappeared,and arrow showed there was almost no phenomenon of inflammatory infiltration and congestion,and the bronchial wall became significantly thinner than that in low-dose SFJDC group;SFJDC+miR-155 siRNA group:arrow showed that inflammatory infiltration and congestion increased compared with highdose SFJDC group.圖2 5組小鼠肺組織形態(tài)
與對(duì)照組相比,模型組肺組織中TGF-β、IL-6 和TNF-α 水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,低、高劑量SFJDC 組肺組織中TGF-β、IL-6和TNF-α水平顯著降低(P<0.05);與低劑量SFJDC 組相比,高劑量SFJDC 組肺組織中 TGF-β、IL-6 和 TNF-α 水平顯著降低(P<0.05);與高劑量SFJDC 組相比,SFJDC+miR-155 siRNA 組肺組織中 TGF-β、IL-6 和 TNF-α 水平顯著升高(P<0.05),見(jiàn)圖3。
與對(duì)照相比,模型組肺組織中miR-155 水平顯著降低(P<0.05),p-JAK1/JAK1 和 p-STAT1/STAT1比值顯著升高(P<0.05);與模型組相比,低、高劑量SFJDC 組肺組織中miR-155 水平顯著升高(P<0.05),p-JAK1/JAK1 和 p-STAT1/STAT1 比值顯著降低(P<0.05);與低劑量SFJDC 組相比,高劑量SFJDC組肺組織中 miR-155 水平顯著升高(P<0.05),p-JAK1/JAK1 和 p-STAT1/STAT1 比值顯著降低(P<0.05);與高劑量SFJDC 組相比,SFJDC+miR-155 siRNA 組肺組織中miR-155 水平顯著降低(P<0.05),p-JAK1/JAK1 和 p-STAT1/STAT1 比值顯著升高(P<0.05),見(jiàn)圖4。
甲型流感病毒H1N1 肺炎在2009 年全球爆發(fā),患者表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、惡心、嘔吐等流感樣癥狀。中醫(yī)認(rèn)為這屬于“寒毒疫”,邪毒侵入人體,正邪相爭(zhēng)而發(fā)熱,故發(fā)熱而口微渴或不渴,飲水少,后期高熱耗傷而出現(xiàn)口渴喜飲;吳又可《溫病條辨》指出:“世多言寒疫者,究其病狀,則憎寒狀熱,頭痛骨節(jié)煩疼,雖發(fā)熱而不甚渴……”[12]。為探索治療甲型流感病毒H1N1 肺炎的有效藥物,本研究利用H1N1 流感病毒建立該疾病的小鼠模型,顯示小鼠肺部肺泡出現(xiàn)明顯斷裂、融合、滲出,肺間質(zhì)出現(xiàn)明顯炎癥浸潤(rùn)、充血、水腫,這些病理改變導(dǎo)致肺部重量增加,導(dǎo)致肺指數(shù)升高,提示模型中小鼠肺組織出現(xiàn)明顯的病理?yè)p傷,模型建立成功。
Figure 3. The levels of TGF-β(A),IL-6(B)and TNF-α(C)in lung tissues of the mice in the 5 groups. Mean±SD. n=10.*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs model group;△P<0.05 vs low-dose SFJDC group;▲P<0.05 vs high-dose SFJDC group.圖3 5組肺組織中TGF-β、IL-6和TNF-α水平比較
中醫(yī)在治療甲型流感病毒H1N1 肺炎中表現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢(shì),中藥SFJDC 以虎杖和連翹為君藥,虎杖具有祛風(fēng)、利濕、破淤、清肝涼血之功效,連翹可清熱解毒、散結(jié)、涼血清腫;諸藥配伍,板藍(lán)根清熱解毒、清血利咽,馬鞭草活血化瘀,敗醬草祛瘀止痛、除癰腫結(jié)熱,柴胡結(jié)表,蘆根清降肺胃、生津止渴;甘草為使,調(diào)和諸藥[13]。本研究檢測(cè)顯示,經(jīng) SFJDC 治療后,模型小鼠肺組織炎癥浸潤(rùn)、充血、水腫現(xiàn)象減少,肺指數(shù)降低,提示SFJDC 能夠減輕肺組織損傷,實(shí)現(xiàn)對(duì)甲型流感病毒H1N1肺炎小鼠肺損傷的緩解,具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。
TGF-β、IL-6 和 TNF-α 與甲型 H1N1 流感病毒關(guān)系密切,甲型H1N1流感病毒侵入機(jī)體后募集多種免疫細(xì)胞,免疫細(xì)胞中單核巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生TGF-β、IL-6 和TNF-α,逐步入侵肺部,刺激內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞釋放一系列炎癥因子,引起免疫損傷[14-15]。本研究結(jié)果亦顯示,模型組肺組織中炎癥因子TGF-β、IL-6 和TNF-α均處于高表達(dá)狀態(tài),SFJDC能夠降低以上因子水平,起到抑炎作用。有研究觀察到miR-155 作為多功能miRNA,可參與天然免疫、特異性免疫過(guò)程,可調(diào)控小膠質(zhì) BV-2 細(xì)胞炎癥因子分泌[16];JAK1-STAT1 通路是眾多細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的共同途徑,參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、炎癥等多種過(guò)程,參與炎癥因子的傳導(dǎo)與調(diào)控[17],其激活在甲型流感病毒FM1 誘導(dǎo)肺炎發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮促進(jìn)作用[18]。此外,miR-155 可調(diào)控下游靶標(biāo)SOCS1 表達(dá),導(dǎo)致JAK1-STAT1 通路磷酸化激活,進(jìn)而使巨噬細(xì)極化、釋放炎癥因子,促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展[19]。以上研究表明,miR-155/JAK1-STAT1 可是在甲型流感病毒FM1 誘導(dǎo)肺炎發(fā)生發(fā)展機(jī)制中發(fā)揮重要作用。本研究顯示,模型組肺組織中miR-155 低表達(dá),JAK1-STAT1 通路處于激活狀態(tài),提示miR-155/JAK1-STAT1 通路參與肺損傷炎癥過(guò)程,與上述研究一致。另添加SFJDC 后,隨著劑量的升高,小鼠肺組織中miR-155 水平逐漸升高,JAK1-STAT1 通路激活程度降低,提示SFJDC 可升高miR-155、抑制JAK1-STAT1通路,這可能是SFJDC 緩解甲型流感病毒H1N1肺炎小鼠體內(nèi)炎癥發(fā)應(yīng)的調(diào)控途徑。故本研究在高劑量SFJDC 基礎(chǔ)上進(jìn)一步使用miR-155 siRNA 下調(diào)miR-155,結(jié)果顯示JAK1-STAT1通路激活程度升高,炎癥因子水平升高,SFJDC 對(duì)甲型流感病毒H1N1 肺炎小鼠的肺組織損傷的緩解作用減弱,表明SFJDC 通過(guò)升高miR-155,進(jìn)而抑制JAK1-STAT1通路激活,降低炎癥反應(yīng),緩解甲型流感病毒H1N1肺炎。
Figure 4. The miR-155 level,and the JAK1,p-JAK1,STAT1 and p-STAT1 protein levels in lung tissues of the mice in the 5 groups. Mean±SD. n=10.*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs model group;△P<0.05 vs low-dose SFJDC group;▲P<0.05 vs high-dose SFJDC group.圖4 5組肺組織中miR-155及JAK1、p-JAK1、STAT1和p-STAT1蛋白水平
綜上所述,SFJDC 可緩解甲型流感病毒H1N1 肺炎小鼠炎癥損傷,其機(jī)制與升高miR-155、抑制JAK1-STAT1通路有關(guān)。