秦依然， 申 程， 尉希清△， 張金國△

（1山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院，山東 濟南 250012；2濟寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科，山東 濟寧 272029）

糖尿病是一種以高血糖為特征的慢性疾病，其患病率在全球范圍內(nèi)不斷上升［1］。其中糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）的發(fā)生具有較高的發(fā)病率和死亡率，其發(fā)病機制尚不清楚［2］。近年來研究表明，高糖（high glucose，HG）與自噬關(guān)系密切［3］。HG 可誘導(dǎo)心肌細胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)、線粒體功能障礙、細胞凋亡從而導(dǎo)致細胞代謝異常和受損細胞器的堆積［4］。自噬是一個高度保守的過程，將廢棄的蛋白質(zhì)或細胞器運送到溶酶體中，以實現(xiàn)細胞的新陳代謝需要和特定細胞器的更新［5-6］。已有研究證實自噬的激活對心肌細胞具有保護作用［7］，因而自噬誘導(dǎo)在疾病治療中可能具有廣闊前景。

黃芪甲苷（astragaloside IV，ASIV）是黃芪的主要藥理提取物，已有2 000 多年的使用歷史［8］。大量研究表明ASIV 在心血管系統(tǒng)中具有多種藥理作用，包括抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗細胞凋亡、調(diào)節(jié)鈣平衡、免疫調(diào)節(jié)和心臟保護作用［9-11］。ASIV 在 2 型糖尿病大鼠模型中能減輕線粒體能量代謝異常，減少細胞凋亡和心肌肥大，減輕心肌損傷［12］。亦有研究表明，ASIV 具有調(diào)控細胞自噬的作用［13］。AMP 活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）作為細胞能量傳感器與自噬關(guān)系密切，可以直接磷酸化Unc-51 樣激酶 1（Unc-51-like kinase 1，ULK1）發(fā)揮作用［14］。然而，ASIV 是否能通過 AMPK/ULK1 信號通路調(diào)控自噬，目前尚未見報道。本項工作建立HG損傷的 H9c2 細胞模型，探索 ASIV 對 HG 損傷 H9c2 心肌細胞自噬的影響及AMPK/ULK1通路調(diào)控機制，為治療DCM提供參考資料。

材料和方法

1 細胞

大鼠H9c2心肌細胞購自中國科學(xué)院細胞庫。

2 主要試劑

ASIV 購自南京春秋生物工程有限公司（純度≥98%）；微管相關(guān)蛋白輕鏈3B（microtubule-associated protein light chain 3B，LC3B）、beclin-1、p62、AMPK、p-AMPK、ULK1、p-ULK1 和 β-actin 抗體均購自 CST；山羊抗兔Ⅱ抗購自ABclonal；Compound C 購自MCE；CoraLite 488 偶聯(lián)山羊抗兔 IgG 購自 Proteintech；BCA蛋白濃度測定試劑盒、LDH 檢測試劑盒、RIPA 裂解液和抗熒光淬滅封片液均購自碧云天生物技術(shù)公司；CCK-8檢測試劑盒購自Dojindo。

3 主要方法

3.1 細胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)H9c2細胞，放置在37 ℃、5% CO2的環(huán)境中，每2～3 d 更換新鮮培養(yǎng)液，待細胞鋪滿瓶底約90%時，傳代或凍存。

3.2 實驗分組 將H9c2 細胞分為含5.5 mmol/L 葡萄糖的低糖對照（control）組、葡萄糖濃度為33.3 mmol/L 的 HG 組［15］、HG+ASIV 組和 HG+ASIV+Compound C 組 。 ASIV 和 Compound C 濃度分別為 100 μmol/L 和5 μmol/L。Compound C 濃度依照藥物說明書確定。ASIV 及Compound C 預(yù)處理H9c2 細胞30 min后加入葡萄糖，各組分別培養(yǎng)72 h。

3.3 CCK-8 法檢測細胞活力 將H9c2 細胞以適宜密度接種于96 孔板，細胞貼壁后進行相應(yīng)處理，到達特定干預(yù)時間后，每孔加入10 μL CCK-8 試劑，培養(yǎng)箱中孵育2 h，測定450 nm 處吸光度，計算細胞活力并確定最佳ASIV干預(yù)濃度。

3.4 LDH 濃度測定檢測細胞損傷 將H9c2 細胞以適宜密度加入96 孔板，細胞貼壁后進行相應(yīng)處理，到達特定干預(yù)時間后，按照試劑盒說明書進行操作，在490 nm 和600 nm 處進行雙波長測定，確定細胞損傷最小時的ASIV濃度。

3.5 Western blot檢測蛋白水平 細胞干預(yù)結(jié)束后，加入RIPA 裂解液進行充分裂解，離心，取出上清，測濃度。按照每組30 μg蛋白上樣，80 V電泳30 min后加至120 V電泳70 min，300 mA轉(zhuǎn)膜90 min，封閉，加入Ⅰ抗后4 ℃過夜，次日孵育Ⅱ抗1～2 h，使用ECL進行化學(xué)發(fā)光顯色，ImageJ軟件分析蛋白灰度值。

3.6 免疫熒光檢測LC3B 熒光強度 各組細胞干預(yù)完成后，加入4%多聚甲醛固定20 min，PBS 清洗；0.2%曲拉通X-100 通透10 min，PBS 清洗；10%山羊血清封閉30 min，加入5%山羊血清配置的Ⅰ抗，4 ℃過夜后PBS 清洗，使用5%山羊血清配置的Ⅱ抗避光孵育1 h，PBS 清洗，滴加適量抗熒光淬滅封片液（含DAPI）于載玻片，置于熒光顯微鏡下拍照。

3.7 透射電鏡觀察細胞自噬 將細胞用2.5%戊二醛固定液固定，切片后染色，使用透射電鏡觀察并拍片。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

使用IBM SPSS Statistics 26 統(tǒng)計軟件進行分析，GraphPad Prism 8 軟件作圖。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。正態(tài)分布的數(shù)據(jù)多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間多重比較采用LSD法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 ASIV提高HG損傷的H9c2細胞活力

單獨使用不同濃度ASIV刺激H9c2細胞72 h，不影響細胞活性，見圖1A。HG 與不同濃度的ASIV 干預(yù)后，結(jié)果顯示HG 組較對照組細胞活性顯著降低（P＜0.05）；與HG組相比，不同濃度的ASIV均可提高HG 條件下的細胞活力（P＜0.05），且呈濃度依賴性，100 μmol/L ASIV效果最佳，見圖1B。

2 ASIV減輕HG誘導(dǎo)的H9c2細胞損傷

LDH 檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，HG 組LDH釋放增多（P＜0.05）；與 HG 組相比，ASIV 可以降低HG 條件下 LDH 的釋放，當(dāng) ASIV 濃度為 50 μmol/L 和100 μmol/L 時，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且100 μmol/L時效果更為顯著，見圖2。選取100 μmol/L為ASIV最佳干預(yù)濃度進行后續(xù)實驗。

3 ASIV對HG環(huán)境下H9c2細胞自噬的影響

Western blot 結(jié)果顯示，與對照組相比，HG 組beclin-1 表達和LC3-II/LC3-I 比值顯著降低（P＜0.05），p62 表達顯著升高（P＜0.05）；與 HG 組相比，HG+ASIV 組 beclin-1 表達和 LC3-II/LC3-I 比值顯著上升（P＜0.05），p62表達顯著下降（P＜0.05），見圖3。

Figure 1. Effects of ASIV at different concentrations on the viability of normal H9c2 cells（A）or effects of ASIV at different concentrations on the viability of H9c2 cells stimulated by HG（B）. Mean±SD. n=4.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs HG group.圖1 不同濃度ASIV在有或無HG刺激時對H9c2細胞活力的影響

Figure 2. Effects of ASIV on LDH release in H9c2 cells. Mean±SD. n=4.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs HG group.圖2 不同濃度ASIV對H9c2細胞LDH釋放的影響

4 ASIV 對 HG 誘導(dǎo) H9c2 細胞 AMPK/ULK1 信 號通路的影響

與對照組相比，HG 組H9c2 細胞中p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1 和 LC3-II/LC3-I 蛋白比值顯著降低（P＜0.05）；與HG 組相比，HG+ASIV 組p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1 和 LC3-II/LC3-I 蛋白比值顯著升高（P＜0.05）；與HG+ASIV組相比，HG+ASIV+Compound C 組 p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1 和 LC3-II/LC3-I蛋白比值均顯著下降（P＜0.05），見圖4。

5 免疫熒光法檢測自噬蛋白LC3B表達

與對照組相比，HG 組LC3B 綠色熒光表達明顯減弱（P＜0.05）；與HG 組相比，HG+ASIV 組細胞核周圍綠色熒光增多（P＜0.05）；與 HG+ASIV 組相比，HG+ASIV+Compound C 組 LC3B 熒光強度減弱（P＜0.05），見圖5。

6 ASIV對HG干預(yù)下自噬體數(shù)量的影響

透射電鏡下觀察，與對照組相比，HG 組內(nèi)自噬體數(shù)目顯著減少（P＜0.05），可見較多線粒體及囊泡化擴張的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；與HG 組相比，HG+ASIV 組自噬體顯著增多（P＜0.05）；給予Compound C 后，自噬體形成顯著減少（P＜0.05），見圖6。

Figure 3. Effects of ASIV on the expression of autophagy-related proteins LC3-I，LC3-II，beclin-1 and p62 in H9c2 cells detected by Western blot. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs HG group.圖3 ASIV對H9c2細胞自噬相關(guān)蛋白LC3I、LC3-II、beclin-1及p62表達的影響

討 論

DCM 是糖尿病的嚴重并發(fā)癥，其發(fā)病率的不斷增長威脅人類生命健康［16］。高血糖會引起多種病理生理改變，包括內(nèi)皮功能障礙、活性氧增多、心肌纖維化、炎癥反應(yīng)增加和細胞死亡等，與DCM 的發(fā)病關(guān)系密切［17-18］。已有研究表明，HG 狀態(tài)下心肌H9c2細胞凋亡和氧化應(yīng)激增多，加重心肌損傷［19］。本研究使用HG 培養(yǎng)H9c2 細胞進行體外實驗，結(jié)果顯示HG 組細胞活力明顯降低和LDH 釋放增多提示細胞損傷模型構(gòu)建成功。

ASIV 作為傳統(tǒng)中藥已被廣泛用于各項體內(nèi)體外研究。You等［20］研究表明，ASIV對HG誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷具有顯著的保護作用。聶佩等［21］研究表明，ASIV 能抑制心肌H9c2 細胞凋亡，減輕氧化應(yīng)激。Zhu 等［15］研究表明，ASIV 可以促進HG 環(huán)境下細胞自噬。以上研究提示ASIV 在各種細胞死亡方式及減輕HG 損傷中具有重要作用。本研究使用不同濃度的ASIV 處理HG 損傷的H9c2 細胞，結(jié)果顯示，ASIV顯著提高細胞活力，減少LDH釋放。

自噬作為細胞死亡方式之一，在維持細胞穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。自噬過程中，胞液形式的LC3-I與磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成LC3-II，然后被募集至細胞膜。LC3-I 到LC3-II 的轉(zhuǎn)換被認為是自噬激活和自噬小體形成的標志［22］。beclin-1 是一種連接蛋白，在自噬啟動中發(fā)揮重要作用。p62 通過直接結(jié)合LC3B 而選擇性地整合至自噬體中，并通過自噬有效降解，其細胞總表達水平與自噬活性負相關(guān)［23］。然而，HG 環(huán)境下心肌細胞自噬的確切作用及其分子機制仍存在爭議，其變化可能具有兩面性。Yu 等［24］研究表明，H9c2 細胞暴露于HG 后，自噬發(fā)生抑制，胰高血糖素樣肽1 激動劑通過激活自噬減輕葡萄糖毒性。Yao 等［25］通過體內(nèi)和體外糖尿病模型，證明了HG 環(huán)境下心肌細胞自噬下調(diào)，而自噬的誘導(dǎo)減輕了糖尿病小鼠的心功能障礙。然而，Zhu等［15］體外模型顯示，HG 條件下高水平的自噬會加重細胞損傷。Zhang 等［26］研究亦表明，HG 條件下過度活躍的自噬對心肌細胞起著不利作用。這些有爭議的結(jié)果可能歸因于不同的模型構(gòu)建、葡萄糖水平及檢測時間等。本研究結(jié)果顯示，HG 處理H9c2 細胞72 h 后，自噬處于低水平狀態(tài)，加入ASIV 后，可以逆轉(zhuǎn)HG 誘導(dǎo)的自噬抑制，誘導(dǎo)心肌細胞發(fā)生保護性自噬。本研究通過對自噬標志蛋白的Western blot 定量分析，證實了維持一定水平自噬具有有益作用。

Figure 4. Effects of ASIV on the expression of AMPK/ULK1 signaling pathway-related proteins in H9c2 cells detected by Western blot. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs HG group；&P＜0.05 vs HG+ASIV group.圖4 ASIV對H9c2細胞AMPK/ULK1通路相關(guān)蛋白表達的影響

Figure 6. The autophagosomes in H9c2 cells under different intervention conditions were observed by transmission electron microscopy（scale bar=1 μm）. Red arrow indicates autophagosomes. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs HG group；&P＜0.05 vs HG+ASIV group.圖6 透射電鏡下觀察不同干預(yù)條件下H9c2細胞內(nèi)的自噬體變化

AMPK 是一個關(guān)鍵的能量感受器，參與自噬、凋亡和蛋白合成等多種病理生理機制，被認為是調(diào)節(jié)心臟代謝的重要因素［27］。AMPK 通過磷酸化ULK1的 Ser317 和 Ser777 位點，激活 ULK1，直接促進自噬［28］。ULK1 是酵母自噬相關(guān)基因ATG1的同源物?；罨腁MPK 還可以抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白以降低ULK1 Ser757 位點的磷酸化，AMPK 進而磷酸化Ser317 上的ULK1，最終誘導(dǎo)自噬［29］。鐵皮石斛多糖可通過AMPK/ULK1 信號通路減輕缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的細胞損傷［30］。ASIV可通過抑制IKK/NF-κB通路減輕炎癥，減輕HG引起的心肌細胞損傷［31］。但目前關(guān)于ASIV 調(diào)節(jié)AMPK/ULK1 信號通路減輕HG 環(huán)境細胞損傷的研究還未見報道。而本研究顯示，HG 模型組AMPK/ULK1 的磷酸化水平被抑制，H9c2 細胞的自噬水平降低。ASIV 可以上調(diào)AMPK/ULK1 的磷酸化水平，恢復(fù)心肌細胞自噬水平。給予AMPK 抑制劑 Compound C 后，ASIV 上調(diào) H9c2 自噬的作用被抑制，進一步證明了ASIV 通過AMPK 通路對H9c2 細胞在HG環(huán)境下促進自噬的作用。

綜上所述，ASIV 可能通過激活A(yù)MPK/ULK1 信號通路調(diào)控自噬，減輕HG 條件下H9c2 細胞損傷。本研究通過構(gòu)建體外模型為ASIV 在DCM 中的保護作用提供了參考資料。此外，調(diào)節(jié)自噬是否是預(yù)防糖尿病相關(guān)心血管疾病的有效策略，下一步擬在DCM動物模型展開進一步研究。