柴詩緣,張安安,梁 健,張晨曦,王成濤,張 嬋，*

(1.北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心,北京工商大學(xué),北京 100048;2.北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心,北京 100048;3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,北京 100193)

紅曲菌是我國重要的藥食兩用微生物資源之一,其發(fā)酵產(chǎn)品紅曲在我國及東南亞地區(qū)有上千年的應(yīng)用歷史,主要用于食品色素、醫(yī)藥、釀酒等方面[1]。紅曲菌能夠產(chǎn)生多種次級代謝產(chǎn)物,包括monacolin K[2]、紅曲色素[3-4]、γ-氨基丁酸[5-8]、麥角固醇[9]、桔霉素[10]等。研究發(fā)現(xiàn),紅曲菌中monacolin K具有抑制膽固醇合成中關(guān)鍵酶HMG-CoA活性的作用[11],所以能夠有效的抑制膽固醇合成,顯著降低其含量,紅曲中monacolin K是1979年日本學(xué)者遠(yuǎn)藤章首次分離得到的[12]。近年來,隨著人們對紅曲藥用、生理價值的深入研究,已經(jīng)開發(fā)出對高血壓、高血脂等具有顯著療效的功能性紅曲產(chǎn)品,如血脂康、脂必妥等。現(xiàn)代研究表明,作為膽固醇合成抑制劑的monacolin K具有高效、低毒、安全等特點[13],是目前醫(yī)藥界公認(rèn)的降低膽固醇的理想藥物之一,因此引起科研工作者的深入研究。

紅曲菌中monacolin K活性成分含量偏低、生產(chǎn)成本高等因素,嚴(yán)重制約了功能性紅曲在降脂降壓方面作用的發(fā)揮,以及功能紅曲產(chǎn)品的大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。近年來,為了提高功能紅曲的品質(zhì),研究人員在優(yōu)化發(fā)酵條件等方面進(jìn)行了大量深入而細(xì)致的研究工作,如Rashmi Dikshit[14]和Lijuan Yu[15]等人通過響應(yīng)面法對培養(yǎng)基發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化來提高monacolin K產(chǎn)量;陳小林[16]、馬義芝[17]和趙樹欣[18]等人通過在培養(yǎng)基中添加不同的誘導(dǎo)物來促進(jìn)monacolin K的合成。由于實驗菌株、處理方法及檢測方法不同,不能很好的確定哪種添加物是最佳誘導(dǎo)物。因此,本文比較了目前已見報道的對于提高紅曲菌monacolin K產(chǎn)量的10種添加物,采用同一菌株,同樣的發(fā)酵條件、處理方法及檢測方法,探尋針對紫色紅曲菌的一種最佳添加物,同時也對這10種添加物對紅曲色素和桔霉素的影響進(jìn)行檢測,為實現(xiàn)功能紅曲高產(chǎn)提供理論依據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫色紅曲菌菌株(MonascusPurpureus)M1 本實驗室保存;葡萄糖、瓊脂、甲醇,色譜純 北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司;甘油、PDA、YPD 北京半夏科技有限公司;monacolin K(純度≥98%)、桔霉素(純度≥98%) Sigma公司。

LDZX-75KBS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;M-pact AX124型分析天平 上海歡奧科技公司;HZQ-F160型全溫振蕩培養(yǎng)箱 太倉市實驗設(shè)備廠;PHS-3D功能型pH計 上海三信儀表廠;20A型高效液相色譜儀、UV-2450型紫外可見光分光光度計 日本島津公司;超凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;SU8010型掃描電子顯微鏡 日本日立公司。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯固體培養(yǎng)培養(yǎng)基[19](PDA)(g/L):葡萄糖20,蛋白胨3,酵母浸粉4,麥芽浸粉20,瓊脂20,KH2PO42,NaNO32,MgSO4.7H2O 1。普通液體種子培養(yǎng)基[19](g/L):葡萄糖30,豆粕粉15,蛋白胨10,甘油70,KH2PO42,NaNO32,MgSO4.7H2O 1。普通液體發(fā)酵培養(yǎng)基[19](g/L)(空白對照組):甘油90,大米粉20,蛋白胨10,KH2PO42.5,NaNO35,MgSO4.7H2O 1,ZnSO4.7H2O 2。山藥粉-發(fā)酵培養(yǎng)基[17](g/L):在普通液體發(fā)酵培養(yǎng)基中按3%(V/V)加入山藥粉。桔皮粉-發(fā)酵培養(yǎng)基[16](g/L):在普通液體發(fā)酵培養(yǎng)基中按2%(V/V)加入桔皮粉。酵母菌液-發(fā)酵培養(yǎng)基[18](g/L):YPD培養(yǎng)基30 ℃平板培養(yǎng)1 d酵母細(xì)胞,用接種環(huán)刮取1環(huán)菌體接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中,30 ℃、200 r/min培養(yǎng)1 d,制備酵母菌液。向普通液體發(fā)酵培養(yǎng)基中按10%(V/V)的接種量接入酵母菌液。酵母上清液-發(fā)酵培養(yǎng)基[18](g/L):發(fā)酵1 d后的酵母菌液經(jīng)12000 r/min離心15 min后取上清,按2.67%(V/V)的接種量接入普通發(fā)酵培養(yǎng)基中。酵母破壁液-發(fā)酵培養(yǎng)基[18](g/L):發(fā)酵1 d后的酵母菌液經(jīng)12000 r/min離心15 min,無菌水洗滌后在滅菌的研缽中研磨10 min后12000 r/min離心15 min,取上清即為酵母破壁液。向普通液體發(fā)酵培養(yǎng)基中按2.67%(V/V)的接種量接入酵母破壁菌液。破壁后的酵母菌液-發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):發(fā)酵1 d后的酵母菌液經(jīng)12000 r/min離心15 min,無菌水洗滌后研磨10 min后12000 r/min離心15 min,取沉淀,按2.67%(V/V)的接種量接入普通發(fā)酵培養(yǎng)基中。亮氨酸-發(fā)酵培養(yǎng)基[17](g/L):在普通液體發(fā)酵培養(yǎng)基中按10 mmol/L加入亮氨酸。谷氨酸-發(fā)酵培養(yǎng)基[17](g/L):在普通液體發(fā)酵培養(yǎng)基中按10 mmol/L加入谷氨酸。乙醇-發(fā)酵培養(yǎng)基[1](g/L):在普通液體發(fā)酵培養(yǎng)基中按2.5%(V/V)加入乙醇。優(yōu)化培養(yǎng)基-發(fā)酵培養(yǎng)基[1](g/L):甘油90,葡萄糖50,蛋白胨10,KH2PO42.5,NaNO35,MgSO4·7H2O 1,ZnSO4.7H2O 2。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種培養(yǎng) 菌株活化:將M1菌株在馬鈴薯固體培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)3 d,活化2代。

種子液的制備:用接種環(huán)刮取1環(huán)菌液到普通液體種子培養(yǎng)基中,30 ℃、200 r/min培養(yǎng)2 d。

發(fā)酵液的制備:按10%的接種量將種子液接種到普通液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,25 ℃、150 r/min培養(yǎng)12 d。

1.3.2 不同添加物對紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)monacolin K、桔霉素和發(fā)酵液色價的影響 將M1菌株在種子液中培養(yǎng)2 d后,將種子液按10%的接種量分別接到普通液體發(fā)酵培養(yǎng)基、山藥粉-發(fā)酵培養(yǎng)基、桔皮粉-發(fā)酵培養(yǎng)基、酵母菌液-發(fā)酵培養(yǎng)基、酵母上清液-發(fā)酵培養(yǎng)基、酵母破壁液-發(fā)酵培養(yǎng)基、破壁后的酵母菌液-發(fā)酵培養(yǎng)基、亮氨酸-發(fā)酵培養(yǎng)基、谷氨酸-發(fā)酵培養(yǎng)基、乙醇-發(fā)酵培養(yǎng)基和優(yōu)化培養(yǎng)基-發(fā)酵培養(yǎng)基中。25 ℃、150 r/min培養(yǎng)12 d后,檢測各培養(yǎng)基中monacolin K、桔霉素及色價產(chǎn)量。其中普通液體發(fā)酵培養(yǎng)基為空白對照組,其余的為實驗組,進(jìn)而確定最佳添加物。

1.3.3 谷氨酸添加量的研究 根據(jù)“2.1”的實驗結(jié)果確定最佳添加物為谷氨酸,為探究谷氨酸的適宜添加量。本實驗在10 mmol/L添加量附近選取8、9、11、12 mmol/L谷氨酸進(jìn)行添加,將發(fā)酵液25 ℃、150 r/min培養(yǎng)12 d后對其monacolin K產(chǎn)量進(jìn)行檢測。

1.3.4 monacolin K的檢測

1.3.4.1 發(fā)酵液的預(yù)處理 各取空白對照組和實驗組發(fā)酵液5 mL,加入15 mL 75%的甲醇,超聲波萃取30 min,靜置過夜,取上清液經(jīng)0.45μm的有機濾膜過濾,檢測濾液中monacolin K含量。

1.3.4.2 monacolin K的檢測 參考王蘭[20]檢測方法。將monacolin K標(biāo)品分別稀釋成5、20、50、80、100、150、200 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液,然后經(jīng)HPLC檢測繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到回歸曲線方程:y=37558x+181164,R2=0.9986,其中橫坐標(biāo)(x)為濃度,縱坐標(biāo)(y)為峰面積,R為相關(guān)系數(shù)。HPLC檢測條件:色譜柱:InertsilODS-3 C18(150 mm×4.6 mm×5 μm),流動相:0.1%磷酸∶甲醇=1∶3,流速1 mL/min,檢測器為紫外檢測器,檢測波長237 nm,檢測溫度30 ℃,進(jìn)樣量10 μL。

monacolin K產(chǎn)量計算公式:

1.3.5 桔霉素的檢測

從J社區(qū)的拆遷案例可以看出，地方政府在回應(yīng)有權(quán)勢的釘子戶抗?fàn)帟r，為了維持基層社會的穩(wěn)定有序，總是在有限的范圍內(nèi)盡可能以“妥協(xié)讓步”的方式尋求與釘子戶的一致約定，這和以往的“硬策略”形成鮮明對比。因此，為了“避免出事”，地方政府在應(yīng)對釘子戶抗?fàn)幧细冻龅某杀竞痛鷥r是高昂的。

1.3.5.1 發(fā)酵液的預(yù)處理 取發(fā)酵液5 mL,加入10 mL無水乙醇,超聲破碎細(xì)胞15 min,60 ℃水浴振蕩1 h,冷卻至室溫,取上清液經(jīng)0.45μm的有機微孔濾膜過濾,檢測濾液中桔霉素含量。

1.3.5.2 桔霉素的檢測 參考黃艷[21]等檢測方法。將桔霉素標(biāo)品分別稀釋成0.05、0.2、2、4、8、12、16 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液,然后經(jīng)HPLC檢測繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到回歸曲線方程:y=6×106x+13203,R2=1,其中橫坐標(biāo)(x)為濃度,縱坐標(biāo)(y)為峰面積,R為相關(guān)系數(shù)。HPLC檢測檢測條件:色譜柱:YMC-Triart C18(250 mm×4.6 mm×5 μm),流動相:乙腈∶水(磷酸調(diào)pH2.5)=35∶65,流速:1.2 mL/min,檢測器:熒光檢測器,激發(fā)波長λex=331 nm,發(fā)射波長λem=500 nm,柱溫28 ℃,進(jìn)樣量20 μL。

桔霉素產(chǎn)量計算公式:

1.3.6 色價的測定 取發(fā)酵液5 mL,加入15 mL 70%的乙醇溶液,于恒溫水浴鍋60 ℃浸提1 h,靜置。用分光光度計測定410、505 nm處吸光值。根據(jù)以下公式計算色價。

紅曲紅色素色價(U/mL)=OD505×稀釋倍數(shù)

紅曲黃色素色價(U/mL)=OD410×稀釋倍數(shù)

1.3.7 生物量的測定 菌絲體生物量采用干重法測定:各取5 mL空白對照組和實驗組的發(fā)酵液,用3層紗布過濾,再用蒸餾水洗滌2～3次,擰干水分,在60 ℃烘箱中烘干至恒重,即為菌絲體干重[22]。

生物量(g/L)=干物質(zhì)質(zhì)量/發(fā)酵液體積

1.3.8 掃描電鏡處理 培養(yǎng)8 d 的紅曲菌菌體,12000 r/min離心5 min收集菌體細(xì)胞,將細(xì)胞重懸于2.5%戊二醛溶液(PBS緩沖溶液稀釋,pH7.2)固定12 h。掃描電鏡樣品處理方法具體參考Zhang[23]等,最后至樣品成粉末狀即可,Eiko IB-3 型離子濺射儀噴金,留待觀察。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗操作重復(fù)三次,采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)計算,SPSS Statistics軟件進(jìn)行多重比較分析,Origin8.5軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基中monacolin K產(chǎn)量的檢測

由圖1可知,當(dāng)在普通培養(yǎng)基中添加山藥粉和谷氨酸時,monacolin K產(chǎn)量與空白對照組相比差異極顯著(p<0.01),產(chǎn)量分別提高了2.49和5.60倍,達(dá)到了107.7和203.8 mg/L;添加亮氨酸時,monacolin K產(chǎn)量與空白對照組相比差異顯著(p<0.05),產(chǎn)量提高了1.12倍,達(dá)到了65.4 mg/L;添加酵母上清液和破壁后的酵母菌液時monacolin K產(chǎn)量也略有提高,但并不顯著;添加酵母破壁菌液和乙醇導(dǎo)致monacolin K的產(chǎn)量降低;而添加桔皮粉則使monacolin K的產(chǎn)量降低至0。推測由于添加桔皮粉導(dǎo)致發(fā)酵液粘稠,溶氧降低后抑制紅曲菌的生長,而紅曲菌是好氧真菌,所以桔皮粉的添加對紅曲菌的生長和monacolin K的合成有著抑制的作用。陳小林等[16]、馬義芝等[17]、朱振元等[24]、趙樹欣等[18]、吳學(xué)倩等[1]分別發(fā)現(xiàn)山藥粉、谷氨酸、酵母破壁液、酵母、酵母上清液液、酵母細(xì)胞破碎液、葡萄糖代替大米粉都可以提高monacolin K的產(chǎn)量。但在本實驗中,只有山藥粉、谷氨酸和山藥粉顯著提高了monacolin K產(chǎn)量,其余物質(zhì)對monacolin K產(chǎn)量的提高并不顯著。

圖1 不同培養(yǎng)基對monacolin K產(chǎn)量的影響Fig.1 Effects of different medium components on monacolin K production in Monascus注:與普通組相比,*代表差異顯著(p<0.05)，**代表差異極顯著(p<0.01);圖2、圖3同。

2.2 桔霉素檢測結(jié)果

結(jié)果如圖2所示,其中添加酵母上清液、谷氨酸和桔皮粉的培養(yǎng)基桔霉素產(chǎn)量稍有變化,但并不顯著;其余幾種培養(yǎng)基桔霉素產(chǎn)量均極顯著(p<0.01)的低于空白對照組;其中添加山藥粉和乙醇的培養(yǎng)基桔霉素產(chǎn)量為0。馬義芝[17]等人發(fā)現(xiàn)精氨酸和亮氨酸可以促進(jìn)紅曲霉桔霉素生成,而賴氨酸,甘氨酸,谷氨酸和酪氨酸抑制桔霉素的生成。結(jié)合2.1的實驗結(jié)果綜合考慮,添加谷氨酸即可以促進(jìn)monacolin K的合成又不會顯著的提高桔霉素的產(chǎn)量,所以選取谷氨酸為最佳添加物。

圖2 不同培養(yǎng)基對桔霉素產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of different medium components on citrinin concentration in Monascus

2.3 色價檢測

由圖3可知,空白對照組紅曲紅色素為47.36 U/mL,紅曲黃色素為35.2 U/mL。與空白對照組相比添加酵母菌液能極顯著(p<0.01)的提高紅曲紅色素產(chǎn)量,提高了37.8%,產(chǎn)量為65.28 U/mL;添加山藥粉和酵母上清液時能顯著(p<0.05)的提高紅曲紅色素產(chǎn)量。當(dāng)添加山藥粉、酵母菌液、酵母上清液和破壁后的酵母菌液時,能極顯著(p<0.01)的提高紅曲黃色素的產(chǎn)量,其中添加酵母菌液后紅曲黃色素產(chǎn)量為最高,提高了51.4%,產(chǎn)量為50.88 U/mL。趙樹欣[20]等人也發(fā)現(xiàn)酵母菌液、酵母上清液和破壁后的酵母菌液可以提高紅曲色素的產(chǎn)量。推測是因為紅曲菌為抵御殼聚糖酶的作用,紅曲菌自身產(chǎn)生疏水性物質(zhì)如紅曲色素。而添加桔皮粉、亮氨酸、谷氨酸、乙醇會對紅曲色素產(chǎn)量產(chǎn)生抑制作用。據(jù)報道色素合成是一個需氧過程,而添加桔皮粉后培養(yǎng)基粘稠度增大,會使溶氧量降低。因此推測添加桔皮粉后會降低培養(yǎng)基溶氧量,從而降低色素產(chǎn)量。張斌[25]等人通過對比20種氨基酸對紅曲色素的影響發(fā)現(xiàn),亮氨酸和谷氨酸會降低紅曲色素的產(chǎn)量,與本研究的結(jié)果具有一致性。

圖3 不同培養(yǎng)基對紅曲色素色價的影響Fig.3 Effects of different medium components on pigments value in Monascus

2.4 不同濃度谷氨酸培養(yǎng)基中monacolin K產(chǎn)量

通過檢測十種培養(yǎng)基的發(fā)酵液,發(fā)現(xiàn)10 mmol/L谷氨酸的添加量可以顯著提高monacolin K的產(chǎn)量,因此本研究通過優(yōu)化谷氨酸的添加量進(jìn)一步探究谷氨酸對紅曲菌的最佳添加量。由圖4可知,當(dāng)谷氨酸的添加量為10 mmol/L時,monacolin K的產(chǎn)量最高,為217 mg/L,所以選取10 mmol/L為最佳添加量并進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖4 不同濃度谷氨酸添加量的培養(yǎng)基中monacolin K產(chǎn)量Fig.4 The monacolin K production in the medium of different glutamate content

2.5 生物量的測定

通過對monacolin K產(chǎn)量的測定發(fā)現(xiàn)谷氨酸可以極顯著(p<0.01)提高monacolin K 產(chǎn)量,所以對谷氨酸培養(yǎng)基中的菌體和普通培養(yǎng)基中的菌體進(jìn)行生物量測定,對比其菌體生長情況。由圖5可知,添加谷氨酸的培養(yǎng)基中菌體重量高于普通培養(yǎng)基中菌體重量,說明谷氨酸可能會促進(jìn)菌體生長,進(jìn)而提高monacolin K產(chǎn)量。

圖5 谷氨酸與原始培養(yǎng)基中菌體干重變化情況Fig.5 The biomass in the glutamic acid medium and the original medium

2.6 掃描電鏡分析

通過掃描電鏡對谷氨酸培養(yǎng)基中的紅曲菌菌絲體形態(tài)進(jìn)行了觀察,掃描電鏡結(jié)果顯示,與對照組相比,谷氨酸培養(yǎng)基中的紅曲菌菌體表面出現(xiàn)皺縮、膨大、彎曲或斷裂現(xiàn)象;對照組中菌絲更加飽滿,菌絲體分枝頂端有單個或多個成鏈狀的分生孢子,孢子呈球形或橢球形。通過圖6中C、F對比可以看出添加了谷氨酸后的菌體皺縮現(xiàn)象更為突出,推測其細(xì)胞膜通透性增強[21],進(jìn)而使胞內(nèi)的monacolin K轉(zhuǎn)移到胞外,從而使發(fā)酵液中monacolin K產(chǎn)量提高。

圖6 不同培養(yǎng)基中不同放大倍數(shù)的紅曲菌 M1 形態(tài)。Fig.6 M1 form of different magnification in different culture medium

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)添加山藥粉、酵母上清液、破壁后的酵母菌液、亮氨酸與谷氨酸均能提高monacolin K產(chǎn)量,其中加入谷氨酸效果極顯著(p<0.01),提升倍數(shù)為5.60倍;山藥粉其次,提升倍數(shù)為2.50倍。結(jié)合桔霉素和色價的測定結(jié)果,發(fā)現(xiàn)添加山藥粉后桔霉素產(chǎn)量大幅降低,紅色素和黃色素產(chǎn)量增加,但monacolin K產(chǎn)量較低;而添加谷氨酸雖然對桔霉素產(chǎn)量影響不顯著,且紅色素和黃色素產(chǎn)量降低,但可以顯著促進(jìn)monacolin K合成,所以選取谷氨酸為最佳促進(jìn)monacolin K合成的添加物。本研究又進(jìn)一步探尋了谷氨酸的最佳添加量,發(fā)現(xiàn)谷氨酸添加量為10 mmol/L時monacolin K產(chǎn)量最高,為217 mg/L。通過掃描電鏡觀測菌絲體形態(tài)變化發(fā)現(xiàn),谷氨酸會使紅曲菌菌體表面皺縮、膨大、彎曲或斷裂現(xiàn)象增多。