董曉燕，林進(jìn)忠，蔣志強(qiáng)

(天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300354)

阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease，AD)是一種 常見的神經(jīng)退行性疾?。洳±硖卣魇谴竽X萎縮、腦組織內(nèi)出現(xiàn)淀粉樣斑塊、腦血管沉淀物和神經(jīng)元纖維纏結(jié)[1-2]，而腦組織中細(xì)胞外的斑塊主要由淀粉樣 β蛋白(amyloid β-peptide，Aβ)沉淀形成[3]．目前研究認(rèn)為，Aβ的聚集和沉積是導(dǎo)致 AD 的主要原因[4]．因此，開發(fā)有效的 Aβ聚集抑制劑，是當(dāng)前防治 AD的研究重點(diǎn)．

研究報(bào)道的淀粉樣蛋白聚集抑制劑主要有小分子[5-6]、多肽及其結(jié)構(gòu)類似物[7-8]、金屬離子[9-10]、蛋白質(zhì)[11-12]和納米抑制劑[13-14]．其中，姜黃素(curcumin，Cur)作為一種多酚類小分子，研究證明其具有良好的抑制Aβ聚集的效果[15]．但它和其他疏水小分子抑制劑[16]類似，在水溶液中溶解度低，易氧化光解，生理?xiàng)l件下穩(wěn)定性差，因此難以發(fā)揮潛在的藥物性能[17-18].

透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)是存在于人體內(nèi)的親水性高分子黏多糖，具有優(yōu)良的生物相容性和可生物降解性，因此近年來受到廣泛關(guān)注[19-21]．Jiang等[22]將 Cur修飾在 HA上，利用 Cur的疏水性形成自組裝納米粒子 Cur-HA(CHA)，實(shí)驗(yàn)證明，其不僅能明顯增加Cur的穩(wěn)定性和溶解度，同時(shí)也能顯著提高Cur抑制Aβ聚集的效果．這是因?yàn)槌薈ur自身的抑制效果外，CHA的高效性還來源于兩個(gè)方面：①隔離作用：HA上修飾的Cur結(jié)合Aβ后，CHA的網(wǎng)狀納米結(jié)構(gòu)能將 Aβ隔離于不同的區(qū)域，使 Aβ之間無法相互作用而抑制其聚集；②疏水結(jié)合-靜電排斥(hydrophobic binding-electronic repulsion，HyBER)作用：Cur不僅可通過疏水作用結(jié)合 Aβ的疏水區(qū)域，還由于 HA帶有大量羧基可使 CHA帶有大量負(fù)電荷，而同時(shí)在 pH＝7.4時(shí) Aβ所帶凈電荷也為負(fù)，它們之間的靜電排斥作用能夠使 Aβ的構(gòu)象伸展，從而抑制聚集或改變聚集路徑為 off-pathway，形成低毒性的聚集體[11]．

筆者前期的研究還發(fā)現(xiàn)，不同 Cur修飾度(substitution degree，SD，表示每100個(gè)HA單體中含有的 Cur個(gè)數(shù))的 CHA具有不同的粒徑和納米結(jié)構(gòu)，而 CHA的納米結(jié)構(gòu)將會影響其抑制 Aβ聚集的效果．當(dāng) SD過大時(shí)，疏水作用強(qiáng)，CHA形成致密的納米結(jié)構(gòu)，使 Aβ無法進(jìn)入納米粒子內(nèi)部與 Cur作用；當(dāng)修飾度過小時(shí)，疏水作用弱，CHA形成疏松的結(jié)構(gòu)，且修飾的 Cur過于分散，無法將 Aβ穩(wěn)定結(jié)合于內(nèi)部從而發(fā)揮隔離作用．只有當(dāng) SD適當(dāng)時(shí)，以上兩種相反效果才能有效協(xié)調(diào)達(dá)到最大抑制效果[22]．

此外在文獻(xiàn)調(diào)研中也發(fā)現(xiàn)，使用不同相對分子質(zhì)量 HA所合成的 CHA納米粒子的性質(zhì)差距也很大[23-24]．因此，改變 HA 的相對分子質(zhì)量可以調(diào)節(jié)CHA的納米結(jié)構(gòu)，不僅可以進(jìn)一步提高抑制效果，還能為進(jìn)一步研究 CHA納米的抑制機(jī)理提供信息．為了進(jìn)一步考察 HA的相對分子質(zhì)量對納米粒子自組裝特性的影響及其對 Aβ聚集的抑制作用，本文選用3種不同相對分子質(zhì)量(40、300和 1,000)的 HA，以不同修飾度修飾上Cur合成了12種CHA，首先考察了HA相對分子質(zhì)量對所形成的CHA結(jié)構(gòu)和性質(zhì)如粒徑、電勢和表觀形貌的影響．而后以 Aβ40為模型蛋白，通過各種分析實(shí)驗(yàn)，考察了 CHA納米粒子對Aβ40聚集的抑制作用，進(jìn)一步揭示CHA對Aβ40聚集的抑制機(jī)理，找出抑制Aβ40聚集的最佳HA相對分子質(zhì)量，為開發(fā)更有效和實(shí)用的 Aβ40聚集納米粒子抑制劑提供了參考依據(jù)．

1 材料及方法

1.1 材料

HA，純度＞95%,，購自上海將來生化試劑有限公司；Cur，純度＞98%,，二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和二甲基氨基吡啶(DMAP)純度均大于 99%,，購自上海晶純生化科技股份有限公司；Aβ40，純度＞95%,，購自上海吉爾生化有限公司；硫黃素T(thioflavin-T，ThT)和MTT為分析純，購自Sigma；培養(yǎng)基和胎牛血清來自Gibco；SHSY-5Y細(xì)胞來自中國科學(xué)院細(xì)胞庫．其余試劑均為分析純，購自天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司.

1.2 方法

1.2.1 姜黃素修飾型自組裝納米粒子的合成

Cur通過酚羥基和 HA上的羧基進(jìn)行酯化反應(yīng)形成 CHA，并在水溶液中自組裝成納米粒子(見圖1)．合成方法如文獻(xiàn)[23]所述：稱取20,mg HA、10,mg的DCC和5,mg的DMAP溶于10,mL的二甲基亞砜(DMSO)水溶液(DMSO 和水體積比 1∶1)中，室溫?cái)嚢?30,min以活化羧基．稱取一定量的 Cur溶于10,mL DMSO，在N2保護(hù)下加入到HA中，將混合體系在 65,℃下攪拌反應(yīng) 6,h．反應(yīng)后的溶液在 DMSO中透析 1～2,d(透析袋截留相對分子質(zhì)量為 14或3.5)，除去未反應(yīng)的 Cur和 DCC、DMAP，再用去離子水透析 3,d，除去其他雜質(zhì)和 DMSO，而后凍干樣品在4,℃下保存．

圖1 CHA納米粒子的形成示意Fig.1 Schematic representation of the formation of CHA nanoparticles

1.2.2 自組裝納米粒子CHA的表征

利用 Tensor 27傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR)(Bruker Optics，Germany)對 HA 和合成的CHA進(jìn)行紅外分析．利用 Lambda35紫外可見光分光光度計(jì)(PerkinElmer，USA)來定量檢測 CHA 中Cur含量．DMSO中Cur和CHA產(chǎn)生的可見光吸收波峰均在 436,nm 處，因此可以制作 Cur在 436,nm下的標(biāo)準(zhǔn)曲線，而后將 CHA以 1,mg/mL溶解于DMSO中，測得其吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出 CHA中 Cur的濃度 cCur，則 HA 的濃度 cHA為(1-MCurcCur)/MHA．式中MCur和MHA分別代表Cur和HA的相對分子質(zhì)量．SD的計(jì)算方法為

采用Zeta Nano電勢納米粒度分析儀(Malvern，UK)測定 CHA在溶液中的 Zeta電勢和水力學(xué)直徑．納米粒子以0.5,mg/mL的質(zhì)量濃度溶解在磷酸鹽緩沖液(PBS，含 100,mmol/L PB和10,mmol/LNaCl，pH＝7.4)中并超聲 5,min，而后在 37,℃下進(jìn)行測量.同時(shí)采用 JEM-2100F透射電子顯微鏡(TEM)(JEOL，Japan)觀察CHA自組裝納米粒子的形貌．1.2.3 CHA納米粒子對Aβ40聚集的抑制作用

采用ThT熒光實(shí)驗(yàn)考察CHA對Aβ40聚集的抑制作用．方法如文獻(xiàn)[11]所述，將 Aβ40以275,μmol/L的濃度溶解在 20,mmol/L NaOH 中形成母液，抑制劑溶解在PBS中，二者按1∶10的體積比混合使 Aβ40 濃度為 25,μmol/L；而后在 150,r/min、37,℃空氣浴中培養(yǎng) 48,h，取出 200,μL培養(yǎng)液加入到2,mL ThT溶液(25,μmol/L)中測熒光強(qiáng)度．使用LS55熒光分光光度儀(PerkinElmer)進(jìn)行檢測．設(shè)定激發(fā)波長為 440,nm，發(fā)射波長為 480,nm，狹縫寬度均為5,nm，每個(gè)樣品掃描3次取平均值．實(shí)驗(yàn)檢測了25,μmol/L Aβ40純培養(yǎng)、Aβ40和 0.5,mg/mL HA 共培養(yǎng)、Aβ40 和 12.5,μmol/L Cur共培養(yǎng)、Aβ40 和含有12.5,μmol/L Cur的 CHA(最大質(zhì)量濃度為0.5,mg/mL)共培養(yǎng) 48,h后的 ThT熒光強(qiáng)度．掃描數(shù)據(jù)減去背景(不含 Aβ40的樣品)的熒光值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以 Aβ40純培養(yǎng)產(chǎn)生的 ThT熒光強(qiáng)度定為100%,，對其他實(shí)驗(yàn)組的 ThT熒光值進(jìn)行歸一化處理后，獲得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)．同時(shí)，采用 CSPM5500原子力顯微鏡(AFM)(廣州本原公司)來觀察 ThT實(shí)驗(yàn)中不同抑制劑作用下的Aβ40聚集體形貌．

Aβ聚集形成的寡聚體和纖維對神經(jīng)細(xì)胞會產(chǎn)生毒性，因此理想的 Aβ聚集抑制劑，除了能抑制 Aβ的聚集和纖維化，還需要能降低 Aβ聚集體的細(xì)胞毒性．本研究利用SH-SY5Y細(xì)胞株，采用MTT細(xì)胞實(shí)驗(yàn)來檢測CHA的解毒作用．首先取80,μL細(xì)胞懸液(含1×103個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)基為含10%,胎牛血清、1%,L-谷氨酰胺和 1%,青霉素-鏈霉素的 DMEM/F12培養(yǎng)基)加入到96孔板中，在37,℃、含5%, CO2的濕潤環(huán)境下培養(yǎng) 24,h；接著將不同條件下預(yù)先培養(yǎng) 24,h的Aβ40樣品(Aβ40濃度均為 25,μmol/L 的純培養(yǎng)、和12.5,μmol/L Cur 共培養(yǎng)、和含 12.5,μmol/L Cur 的CHA共培養(yǎng))加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，每孔加入20,μL，使得 Aβ 終濃度為 5,μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng) 24,h；然后加入 10,μL的 MTT(5.5,mg/mL溶于 PBS)再培養(yǎng)4,h；而后將96孔板在1,500,r/min下離心10,min，除去孔內(nèi)的培養(yǎng)基，每孔中加入 100,μL的 DMSO，150,r/min搖床中振蕩 10,min使紫色結(jié)晶均勻溶解；而后用酶標(biāo)儀檢測 570,nm下的吸光值(TECAN Infinite，Switzerland)．所有實(shí)驗(yàn)組設(shè)置 6個(gè)平行，以純培養(yǎng)基組作為空白組，純細(xì)胞組作為對照組．實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Graphpad Prism統(tǒng)計(jì)軟件通過t-test方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，p＜0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性．

細(xì)胞存活率的計(jì)算方法為

2 結(jié)果與討論

2.1 自組裝納米粒子的表征

FTIR光譜證明 Cur成功修飾在 HA上．如圖 2所示，1,730,cm-1處是酯鍵上的 C＝O 雙鍵的伸縮振動吸收譜帶，1,160,cm-1處是酯鍵上 C—O的吸收譜帶；同時(shí)，1,648,cm-1出現(xiàn)的吸收峰是Cur上的C＝C的伸縮振動吸收峰，這和文獻(xiàn)[23]結(jié)果是一致的，證明Cur和HA通過酯化反應(yīng)形成CHA．

圖2 Cur、HA300和CHA300-4的紅外光譜圖Fig.2 FTIR spectra of Cur, HA300 and CHA300-4

CHA的SD通過紫外可見光光譜來計(jì)算．如圖3所示，DMSO中Cur和CHA產(chǎn)生的可見光吸收波峰均在 436,nm處，得到的 Cur在 436,nm下的標(biāo)準(zhǔn)曲線為 y＝0.022,5,x，而后根據(jù) CHA 的吸收峰值計(jì)算SD．本研究合成的 CHA的SD主要分布在1～4之間(見表 1)，如 4個(gè) CHA300的 SD 分別為 1.17、1.91、2.42和3.03．

圖3 HA300、Cur和CHA300-4的紫外可見光光譜Fig.3 UV-Vis spectra of HA300, Cur and CHA300-4

表1 不同CHA的Zeta電勢和DLS粒徑Tab.1 Zeta potentials and DLS sizes of different kinds of CHA

形成的 CHA是一種兩親性共聚物．在水溶液中，CHA的 Cur會在疏水作用力的驅(qū)動下自聚集成為納米結(jié)構(gòu)的疏水核心，而 HA纏繞包裹在 Cur外圍，由于 HA帶有負(fù)電荷，因此 HA各單體間存在一定的靜電排斥，因此 CHA可能會形成具有空腔結(jié)構(gòu)的納米粒子[22-23]，如圖 1所示．通過 DLS實(shí)驗(yàn)分析CHA的 Zeta電勢和粒徑分布，結(jié)果見表 1和圖4．由圖4(a)可以看出，形成的所有CHA納米粒子所帶電荷均為負(fù)值，并且同一種相對分子質(zhì)量HA形成的 CHA，其 Zeta電勢會隨 SD增高而降低．這是由于 HA主鏈帶有負(fù)電羧基基團(tuán)，修飾上少量 Cur后HA依然帶負(fù)電，因此電勢值為負(fù)；Cur上的羥基和HA上的羧基通過酯化反應(yīng)結(jié)合，Cur修飾越多，HA上的負(fù)電羧基基團(tuán)被反應(yīng)的越多，因此測得的 Zeta電勢絕對值隨SD增大而逐漸變小．

圖4 12種CHA在PBS中的Zeta電勢和DLS粒徑Fig.4 Zeta potentials and DLS sizes of 12 kinds of CHA in PBS

而從圖 4(b)可知，3類 CHA的粒徑均具有 SD依賴特性，即 SD越大，其粒徑越小．這是由于 CHA納米粒子是由多個(gè)CHA長鏈通過Cur的疏水作用自組裝形成的納米粒子．SD 越大，Cur的比例越高，疏水作用越大，形成的納米粒子結(jié)構(gòu)越緊密，因此粒徑越?。甌EM 實(shí)驗(yàn)結(jié)果也得到一致的規(guī)律，如 4種CHA300納米粒子均呈近球形的不規(guī)則顆粒狀，并且顆粒大小隨著 SD 的提高逐漸降低(見圖 5)．由此可見，CHA的粒徑隨著SD的增加而減小；Zeta電勢隨著 SD的增加而升高．這與文獻(xiàn)[19-20]的結(jié)果相一致．說明 CHA具有可調(diào)節(jié)電勢和粒徑的性質(zhì)，這對CHA的實(shí)際應(yīng)用非常有利．

2.2 CHA納米粒子對Aβ40聚集的抑制作用

CHA納米粒子對 Aβ40聚集的抑制作用通過ThT熒光實(shí)驗(yàn)來檢測，結(jié)果如圖 6(a)所示(圖中CHAx的 x指代 40、300和 1,000)．以 Aβ40純培養(yǎng)48,h的 ThT 熒光強(qiáng)度為 100%,，12.5,μmol/L 的 Cur能使 Aβ40的熒光強(qiáng)度降低到 68.5%,；當(dāng) Aβ40中加入不同的 CHA共培養(yǎng)后，Aβ40的熒光強(qiáng)度值都明顯降低，其中CHA40-2、CHA300-2和CHA1000-3的抑制效果都顯著優(yōu)于同濃度的姜黃素，見圖 6(b)，其中***代表和 Aβ+Cur組對比的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性 p＜0.001．作為對照，3種 HA對 Aβ40的熒光強(qiáng)度值基本沒有影響(見圖 6(c))．同時(shí)從圖 6(a)還可以看出，同一 HA相對分子質(zhì)量形成的幾個(gè) CHA，對Aβ40聚集的抑制效果并不相同，隨著SD的提升，抑制效果先提高后降低，即存在一個(gè)最佳 SD，使得CHA 對 Aβ40的聚集有最好的抑制效果．如 4種CHA300，當(dāng) SD 為 1.17(CHA300-1)時(shí)，ThT 熒光強(qiáng)度降低到 66.3%(與純姜黃素相當(dāng))，當(dāng) SD 提高到1.91(CHA300-2)時(shí)，抑制效果最佳，熒光強(qiáng)度降低到45.6%．但繼續(xù)提高SD到2.42和3.03時(shí)，抑制效果則會逐漸降低．

圖5 4種CHA300的TEM形貌圖Fig.5 TEM images of 4 kinds of CHA300

這可能和CHA的納米粒子結(jié)構(gòu)有關(guān)，CHA在水溶液中會形成具有空腔結(jié)構(gòu)的納米粒子[22-23]．因此Aβ40單體能夠進(jìn)入 CHA 內(nèi)部，修飾的 Cur結(jié)合Aβ40后能夠?qū)⑵涔潭ㄓ?CHA內(nèi)部某區(qū)域，使 Aβ40分子之間無法相互作用而起到隔離作用．同時(shí)，CHA納米粒子攜帶的負(fù)電荷能和 Aβ40產(chǎn)生靜電排斥，也可能引起 Aβ40單體構(gòu)象的伸展，改變聚集路徑為off-pathway，因此 CHA納米粒子能提高 Cur的抑制Aβ40聚集的效果(HyBER作用)[11]．而 CHA的 SD能夠影響納米結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響隔離作用和 HyBER作用．純 Aβ40會聚集形成長纖維(見圖 7(a))，而當(dāng)加入SD較小的CHA時(shí)(見圖7(b))，CHA表面的靜電排斥和空間位阻較小，不影響 Aβ40進(jìn)入，但形成的納米結(jié)構(gòu)過于疏松，隔離作用無法有效發(fā)揮；當(dāng) SD適中時(shí)(見圖7(c))，隔離作用和HyBER作用的協(xié)同使其具有最好的抑制 Aβ40聚集的效果；當(dāng) SD過大時(shí)(見圖 7(d))，形成的致密納米結(jié)構(gòu)以及表面負(fù)電荷的靜電排斥會導(dǎo)致 Aβ40無法有效進(jìn)入 CHA內(nèi)部，從而無法與 Cur作用進(jìn)而發(fā)揮隔離作用與HyBER作用．這個(gè)結(jié)果與之前的結(jié)果相一致[22]，證明了不同相對分子質(zhì)量 HA修飾上 Cur后形成的CHA均可成為一種 Aβ聚集的抑制體系，且其抑制效果依賴于SD及其納米結(jié)構(gòu)．

圖6 不同抑制劑對Aβ40聚集的ThT熒光強(qiáng)度的影響Fig.6 Influence of different inhibitors on Aβ40 aggregation measured by ThT fluorescence

此外，HA相對分子質(zhì)量越高，形成的CHA的最佳 SD越大(如 CHA1000的最佳 SD為 3.57，CHA300的最佳SD為1.91，而CHA40的最佳SD為1.41)．HA 相對分子質(zhì)量越大，其鏈越長，在自組裝過程中越容易受到空間位阻的影響，而形成結(jié)構(gòu)較為疏松的結(jié)構(gòu)．因此高相對分子質(zhì)量HA形成結(jié)構(gòu)適中的最佳SD越大．

圖7 Aβ40聚集和CHA抑制Aβ40聚集機(jī)理Fig.7 Mechanism diagram of Aβ40 aggregation and inhibiting by CHA

對比上述 3個(gè)最佳 SD下的 CHA的抑制效果(見圖6(b))還可以發(fā)現(xiàn)，在最佳SD下CHA300-2對Aβ40聚集具有最好的抑制效果，CHA40-2次之，CHA1000-3再次之．如前所述，高相對分子質(zhì)量 HA自組裝的CHA結(jié)構(gòu)疏松而低相對分子質(zhì)量HA自組裝的CHA結(jié)構(gòu)緊密，而相對分子質(zhì)量300的HA自組裝形成的 CHA結(jié)構(gòu)適中，其抑制效果要略優(yōu)于另兩類 CHA(均在最佳 SD 下)．這說明，在最佳 SD下，由300相對分子質(zhì)量的HA形成的CHA要優(yōu)于1,000和40的，這可能是由于CHA300-2具有最佳的納米結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)的緊密程度適中，不會過于緊密而使Aβ40無法進(jìn)入 CHA 內(nèi)部結(jié)合姜黃素，同時(shí)不會過于疏松而失去隔離效果，因而具有最好的抑制效果．

圖8(a)為通過AFM考察CHA對Aβ40聚集體的形貌影響．純Aβ40在培養(yǎng)48,h后，形成大量的成熟纖維；而對照 HA300并不影響 Aβ40聚集體的形貌(見圖 8(b))；12.5,μmol/L 的 Cur能使纖維變細(xì)，纖維量變少，形成一些無定型聚集體[25](見圖8(c))；但當(dāng)培養(yǎng)體系中分別加入含 12.5,μmol/L Cur的CHA300后，Aβ40聚集體形貌發(fā)生了明顯的改變，AFM圖像中基本觀察不到長纖維，這也表明CHA抑制 Aβ40聚集的效果優(yōu)于游離態(tài)的Cur(見圖 8(d)～(g))．同時(shí)可以看出，Aβ40中加入 CHA300-1共培養(yǎng)后(見圖 8(d))，Aβ40纖維變短變細(xì)，同時(shí)出現(xiàn)了不規(guī)則的短棒狀聚集體；當(dāng) Aβ40中加入 CHA300-2后(見圖 8(e))，聚集體形貌變化更加明顯，長纖維消失，同時(shí)產(chǎn)生較多的短纖維和球形聚集體；同樣CHA40和 CHA1000對 Aβ40聚集體的形貌也有類似的影響規(guī)律(見圖 9)，即在最佳 SD下的 CHA對Aβ40聚集的抑制效果更好，這個(gè)結(jié)果同ThT實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(見圖 6(a))是一致的．由于 Aβ40+CHA 共培養(yǎng)形成的聚集體形貌(見圖8(e))與Aβ40+Cur組的聚集體形貌(見圖8(c))明顯不同，表明CHA能夠改變 Aβ40的聚集路徑，這可能是由于 CHA 發(fā)揮了HyBER機(jī)理(見圖 7)而改變了 Aβ40的構(gòu)象所導(dǎo)致的．

圖8 HA300、Cur和CHA300對Aβ40聚集體形貌的影響Fig.8 Influence of HA300, Cur and CHA300 on the morphologies of Aβ40 aggregates

圖9 HA和CHA對Aβ40聚集體形貌的影響Fig.9 Influence of HA and CHA on the morphologies of Aβ40 aggregates

2.3 CHA納米粒子對Aβ40聚集體毒性的影響

選擇 ThT實(shí)驗(yàn)中抑制效果最好的 3種 CHA(CHA40-2、CHA300-2 和 CHA1000-3)，通過 MTT考察其對 Aβ40聚集體的細(xì)胞毒性的影響．圖 10是這3種CHA對Aβ40聚集體的細(xì)胞毒性的影響．以純細(xì)胞組的存活率為 100%,，5,μmol/L的 Aβ40使得細(xì)胞存活率降低到 59.6%,，說明 Aβ40具有一定的細(xì)胞毒性，而 HA 本身并不會降低 Aβ40的細(xì)胞毒性．加入 Aβ40和 Cur共培養(yǎng)液后，細(xì)胞存活率提高到 67.4%,，說明 Cur能略微降低 Aβ40的細(xì)胞毒性；而加入同Cur濃度的CHA后，細(xì)胞存活率有著顯著的提高，尤其加入CHA300-2后，和Aβ40組相比，細(xì)胞存活率提高了27.7%,．結(jié)合前面ThT熒光實(shí)驗(yàn)(圖6(b))、AFM實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見圖8和圖9)可知，CHA能改變 Aβ40聚集路徑，通過 off-pathway產(chǎn)生毒性較低的聚集體，從而有效抑制 Aβ40產(chǎn)生的細(xì)胞毒性，并且抑制效果明顯高于同濃度的Cur．此外，最佳SD下的3類CHA中，依然是由相對分子質(zhì)量300的HA形成的CHA300-2的效果最佳，進(jìn)一步表明了HA的相對分子質(zhì)量會影響CHA在最佳SD下的效果．

同時(shí)對照實(shí)驗(yàn)(見圖 11)還顯示，CHA 的包裹作用能降低 Cur的細(xì)胞毒性．由圖可知，HA對細(xì)胞的生長沒有影響；而2.5,μmol/L的Cur能使細(xì)胞存活率降低到 89.1%,，這說明 Cur對細(xì)胞有輕微的毒性作用；當(dāng)加入含有2.5,μmol/L Cur的CHA時(shí)，細(xì)胞存活率有所提高，上升到95.1%～97.6%，這說明Cur在形成 CHA納米粒子后，納米粒子的包裹作用能有效降低Cur對細(xì)胞的損傷，表明CHA是一種安全的納米藥物載體．

圖10 HA、Cur和CHA對Aβ40導(dǎo)致的細(xì)胞毒性的影響Fig.10 Inhibitory effect of HA, Cur and CHA on Aβ40-induced cytotoxicity

圖11 HA、Cur和CHA自身的細(xì)胞毒性Fig.11 Cytotoxicity of HA, Cur and CHA towards SHSY-5Y cells

3 結(jié) 語

納米粒子常被作為藥物載體來輸送 Cur，而本文則是Cur修飾在HA上，利用姜黃素的強(qiáng)疏水性來自組裝成納米抑制劑，用于抑制淀粉樣蛋白的聚集．Cur使Aβ40產(chǎn)生無定型聚集體，而CHA通過隔離作用和 HyBER作用，使其生成了碎片纖維和球形聚集體，并且提高了抑制效果．同時(shí)，相對分子質(zhì)量對自組裝納米抑制劑的藥物性能的影響鮮有研究，本文深入研究了HA相對分子質(zhì)量、Cur修飾度等因素對自組裝納米粒子 CHA抑制 Aβ40聚集的影響，發(fā)現(xiàn)HA相對分子質(zhì)量越大，形成的CHA納米結(jié)構(gòu)越疏松，其最佳SD越大；同時(shí)，當(dāng)HA相對分子質(zhì)量為300、Cur的 SD 為 1.9時(shí)，CHA 的納米結(jié)構(gòu)最為合適，其抑制效果最好．這對自組裝納米藥物的設(shè)計(jì)和合成具有重要的參考意義．

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