關(guān)建華 ，靳祎祎 ，莊群川 ，2，黃 彬 ，彭 軍 ，2，魏麗慧 ，2，林久茂 ，2

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122）

血管生成在腫瘤發(fā)生等病理生理過程中起重要作用。腫瘤血管新生與腫瘤生長及遷移有著密不可分的聯(lián)系［1］，新生的血管為腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移提供氧氣和營養(yǎng)，與腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。若無血管系統(tǒng)提供氧氣和養(yǎng)料，實(shí)體瘤的增長不會超過1 mm3，因此，抗血管生成是腫瘤治療的主要策略。血管新生是個復(fù)雜的過程，主要涉及血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移等過程［2］。名貴中成藥八寶丹（Babao Dan，BBD）具有清熱利濕、活血解毒、祛黃止痛等功效。相關(guān)研究顯示BBD治療腫瘤臨床療效顯著，可明顯減輕化療藥物對肝功能的損傷，與化療合用可以減緩患者痛楚，改善臨床癥狀，提高生活質(zhì)量，減輕或延緩化療藥物引起的外周血象下降速度，降低感染的幾率，延長臨床生存期［3-4］。同時，研究結(jié)果表明八寶丹干預(yù)后的腫瘤細(xì)胞增殖能力降低，凋亡增加，細(xì)胞遷移數(shù)目減少［5］。但BBD抗腫瘤作用機(jī)制方面的研究尚不系統(tǒng)和深入，多停留在藥效作用觀察上。本文通過觀察BBD對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的影響，探討其抑制腫瘤血管新生的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC），購于中南大學(xué)湘雅細(xì)胞中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 BBD（廈門中藥廠股份有限公司，0.3 g／粒），使用磷酸鹽緩沖液（PBS）配制成 25 mg／mL的藥液。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶、RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Life technologies公司）；青霉素-鏈霉素混合液（美國Thermo公司）；MTT粉末、結(jié)晶紫（北京索萊寶科技有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；DMIL LED倒置顯微鏡系統(tǒng)（德國Leica公司）；連續(xù)波長多功能酶標(biāo)儀（奧地利TECAN公司）；Countes?全自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國Life technologies公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HUVEC采用RPMI 1640完全培養(yǎng)基（含 10%FBS、100 U／mL 青霉素、100 μg／mL 鏈霉素），置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 細(xì)胞活力分析 采用MTT法進(jìn)行細(xì)胞活力分析。取對數(shù)生長期的HUVEC按1×104個／孔接種于96孔培養(yǎng)板中（100 μL／孔），培養(yǎng)細(xì)胞匯合度達(dá)到50%～60%時，將細(xì)胞分成對照組和實(shí)驗(yàn)組，吸棄培養(yǎng)液，對照組每孔加入不含BBD的培養(yǎng)液100 μL，實(shí)驗(yàn)組每孔加入含不同濃度 BBD（0.25、0.5、0.75 mg／mL）培養(yǎng)液 100 μL，培養(yǎng) 24 h 后每孔加入100 μL MTT（0.5 mg／mL）繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，吸棄液體后加入 DMSO 100 μL／孔，室溫放置 10 min，充分振蕩混勻后于酶標(biāo)儀（波長570 nm）測吸光度（A）值。細(xì)胞活力與細(xì)胞生長抑制率計(jì)算公式如下。

細(xì)胞活力／%＝實(shí)驗(yàn)組A值／對照組A值×100%；

細(xì)胞生長抑制率／%＝（對照組A值－實(shí)驗(yàn)組A值）／對照組A值×100%。

2.3 觀察細(xì)胞形態(tài) 取對數(shù)生長期的HUVEC按2×105個／孔接種于 6孔培養(yǎng)板中（2 mL／孔），培養(yǎng)細(xì)胞匯合度達(dá)到50%～60%時，細(xì)胞經(jīng)不同濃度BBD（0、0.25、0.5、0.75 mg／mL）干預(yù) 24 h 后，使用倒置顯微鏡對細(xì)胞的形態(tài)變化進(jìn)行觀察并拍照。

2.4 劃痕損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期的HUVEC按6×105個／孔接種于6孔培養(yǎng)板中（2 mL／孔），當(dāng)匯合度達(dá)到80%～90%時進(jìn)行劃痕，用20 μL無菌槍頭裝于移液器槍頭處，握住移液器采用一定力度垂直于板底進(jìn)行橫線劃痕，隨后吸出原培養(yǎng)基，每孔加1 mL PBS清洗3遍，最后一次PBS保留不吸出，拍照即記為0 h，然后吸棄PBS，加入含不同濃度 BBD（0、0.25、0.5、0.75 mg／mL）的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，分別干預(yù)12 h和24 h后隨機(jī)取5個視野，倒置顯微鏡下觀察拍照。

2.5 Transwell遷移分析 HUVEC經(jīng)不同濃度BBD（0、0.25、0.5、0.75 mg／mL）干預(yù)處理 24 h 后，吸棄含藥培養(yǎng)基，消化離心收集細(xì)胞，用空白培養(yǎng)基重懸調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×105個／mL，上室內(nèi)加入200 μL 包含有 5×104個細(xì)胞，下室加入 700 μL 完全培養(yǎng)基，放入恒溫箱培育12 h后吸棄培養(yǎng)基，用干棉棒輕輕擦拭小室內(nèi)部，使用蘸有PBS的棉簽輕輕擦拭小室內(nèi)部（切記不要捅破小室）；4%多聚甲醛固定和結(jié)晶紫染色，PBS洗滌后于倒置顯微鏡鏡下隨機(jī)選取5個視野拍照。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 BBD對HUVEC增殖的影響 見表1。

3.2 BBD對HUVEC形態(tài)的影響 倒置顯微鏡觀察結(jié)果顯示HUVEC經(jīng)不同濃度BBD干預(yù)24 h后，BBD可減少HUVEC的細(xì)胞密度，并使部分細(xì)胞脫落，呈劑量依賴作用。見圖1。

3.3 BBD對HUVEC劃痕損傷修復(fù)的影響 劃痕損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示BBD對HUVEC的劃痕損傷修復(fù)具有明顯的抑制作用，且具有明顯的劑量依賴。見圖2。

表1 BBD 對 HUVEC 增殖的影響（n＝8，x±s）

圖1 BBD對HUVEC形態(tài)的影響（×200）

圖2 BBD對HUVEC劃痕損傷修復(fù)的影響（×100）

3.4 BBD對HUVEC遷移能力的影響 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示BBD對HUVEC的遷移能力有明顯的抑制作用，隨著BBD劑量增大，遷移的細(xì)胞逐漸減少，具有顯著的量效作用。見圖3。

4 討 論

圖3 BBD對HUVEC遷移能力的影響（×100）

腫瘤生長及其轉(zhuǎn)移灶形成的最根本原因是依賴于血管的形成［6］。血管新生在實(shí)體腫瘤的生長、惡變以及轉(zhuǎn)移等方面至關(guān)重要［7］，是一個復(fù)雜的、受高度調(diào)控的生理過程［8］，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞向腫瘤移行是一個重要環(huán)節(jié)，內(nèi)皮細(xì)胞通過增殖、游走、黏附到相應(yīng)部位構(gòu)成血管樣結(jié)構(gòu)，這表明抗血管生成治療在抑制腫瘤進(jìn)展方面是有效的［9］。因此，針對抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移，使腫瘤血管生成得到抑制，從而切斷腫瘤細(xì)胞的營養(yǎng)來源，抑制其生長與轉(zhuǎn)移。

BBD起源于明代，距今已有四百多年的臨床應(yīng)用歷史，主要由牛黃、三七、羚羊角、蛇膽、珍珠、麝香等藥物組成，具有清利濕熱、活血解毒、去黃止痛之功效［10］，其臨床應(yīng)用于治療傳染性病毒性肝炎、急性膽囊炎、急性泌尿系感染等。近年來，圍繞其清熱利濕、活血止痛、抗炎解毒的功能，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)專家不斷探討與實(shí)踐，該方應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大，在惡性腫瘤、自身免疫性疾病以及其他疑難雜癥的治療方面也取得了良好的效果［3-5，11］。

在本研究中，我們以HUVEC為研究對象，用不同濃度BBD進(jìn)行干預(yù)，觀察其對HUVEC的增殖和遷移的影響，MTT檢測結(jié)果顯示不同濃度的BBD可顯著抑制HUVEC的增殖，具有一定的劑量依賴性。血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移是血管新生的重要驅(qū)動因素，劃痕（修復(fù)）法是簡捷測定細(xì)胞遷移運(yùn)動與修復(fù)能力的方法，體外觀察細(xì)胞是否生長（修復(fù)）至中央劃痕區(qū)，以此判斷細(xì)胞的生長遷移能力［12］。在本實(shí)驗(yàn)中，BBD對HUVEC的劃痕損傷修復(fù)具有明顯的抑制作用，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴作用，提示BBD可抑制HUVEC細(xì)胞的遷移能力。此外，血管內(nèi)皮細(xì)胞穿透基底膜脫離原部位是發(fā)生血管新生的另一關(guān)鍵環(huán)節(jié)。Transwell是通過計(jì)算相同時間內(nèi)穿過小孔膜的細(xì)胞數(shù)來反映細(xì)胞遷移能力，穿過小孔膜的細(xì)胞數(shù)越多，遷移能力越強(qiáng)［12］。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對照組有較多的細(xì)胞穿過小孔膜，BBD干預(yù)后穿過小孔的細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，說明BBD能顯著降低HUVEC的遷移能力。

綜上可見，BBD可通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及遷移來發(fā)揮抑制血管新生的作用，為此提示BBD治療腫瘤的作用機(jī)制可能與其抑制腫瘤血管新生有關(guān)。但血管新生是個復(fù)雜的過程，涉及多個因素、多個環(huán)節(jié)、多種細(xì)胞因子、多條信號通路等協(xié)同調(diào)控的多步驟過程，因此有關(guān)BBD抑制血管新生的分子作用機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。

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