劉 赟 ,林心君 ,施 紅 ,許 茜
(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)臨床技能教學(xué)中心,福建 福州 350122;2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,福建 福州 350122)
目前,全世界糖尿病患者日趨增多,據(jù)世界衛(wèi)生組織估量,至2050年,全球糖尿病患者將超過3億。糖尿病患者存在脂代謝紊亂的情況,而肝臟脂代謝的異常又能促進(jìn)2型糖尿病的發(fā)展。有研究表明,慢性游離脂肪酸的升高和胰島細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的增加能促使胰島β細(xì)胞凋亡;高脂血癥又使糖尿病患者心血管疾病的發(fā)病率增加,因此在治療糖尿病的同時(shí)要積極降低患者的血脂[1]。石斛合劑具有滋陰、清熱、益氣、活血、瀉濁等功效,通過以往的研究發(fā)現(xiàn),該合劑能夠降低糖尿病大鼠血糖,改善血脂,并且其作用顯著優(yōu)于西藥二甲雙胍[2-3]。本研究通過對(duì)衰老糖尿病大鼠肝臟基因芯片的分析,探討石斛合劑調(diào)控衰老糖尿病大鼠肝臟脂代謝的作用機(jī)制。
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 50只12周齡SPF級(jí)雌性Wistar大鼠,體質(zhì)量(200±20)g,由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供,許可證號(hào):SCXK(滬)2017-0005。
1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 石斛合劑1、2號(hào)方:石斛、黃芪、五味子、丹參等,3號(hào)方:茵陳、大黃、梔子、五味子等。鹽酸二甲雙胍緩釋片(廣東省藥物研究所制藥廠)。
1.3 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 烏拉坦(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):T20100310);基因表達(dá)譜雜交試劑盒(Agilent technologies,Santa Clara,CA,US,Cat#5188-5242);基因表達(dá)譜洗片試劑盒(Agilent technologies,Santa Clara,CA,US,Cat#5188-5327);兔抗鼠-β-catenin多克隆抗體(武漢博士德生物技術(shù)公司);基因芯片掃描儀(Agilent technologies,Santa Clara,CA,US,Cat#G2565CA);7180 型自動(dòng)生化分析儀(日立公司);FJ2008PS型γ放射免疫計(jì)數(shù)器(西安核儀器廠)。
2.1 藥液制備 石斛合劑1、2、3號(hào)方分別按生藥含量為2.0 g/mL滅菌后100 mL分裝一瓶,分裝保存?zhèn)溆谩?/p>
2.2 建立模型 適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d,根據(jù)課題組前期工作研究[2],隨機(jī)分為正常對(duì)照組10只和造模組40只,分別喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料和高脂高糖飼料12個(gè)月后,造模組予腹腔注射低劑量的鏈脲佐菌素(STZ)20 mg/kg,注射 1次,3 d之后篩選出隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L的衰老糖尿病模型大鼠32只,隨機(jī)分為模型組10只、二甲雙胍組10只、石斛合劑組12只。
2.3 干預(yù) 石斛合劑組按 12 g/(kg·d)予石斛合劑灌胃,第1~5天予石斛合劑1號(hào)方灌胃,第6~10天予石斛合劑2號(hào)方灌胃,第11~12天予石斛合劑3號(hào)方灌胃,此為1個(gè)療程,共灌胃2個(gè)療程;二甲雙胍組按 50 mg/(kg·d)予二甲雙胍灌胃;正常對(duì)照組和模型組予等量生理鹽水灌胃。每日1次,共干預(yù)24 d。
2.4 觀察指標(biāo)及方法
2.4.1 生化指標(biāo)檢測(cè) 動(dòng)物處死后取腹主動(dòng)脈血,應(yīng)用自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)和膽固醇(CHOL)。
2.4.2 HE染色 取肝臟切片常規(guī)脫臘,入水。100%酒精脫洗5 min 2次,95%酒精、80%酒精各脫洗5 min,自來水充分沖洗5 min。蘇木素浸泡5 min,自來水沖洗;1%鹽酸分化,自來水沖洗;伊紅染液中染色2 min;依次于70%、80%、90%、95%酒精梯度酒精脫水各2 min,100%酒精10 min脫水2次,二甲苯透明后,中性樹膠封片。
2.4.3 免疫組化檢測(cè)肝臟β-鏈蛋白(β-catenin)表達(dá)量 包埋、切片、脫蠟和水化后,用自來水沖洗。對(duì)組織抗原進(jìn)行相應(yīng)的修復(fù),并用 PBS沖洗3次,除去PBS液。每張片加1滴或50 μL 3%過氧化氫,在室溫下孵育10 min,PBS沖洗3次,各3 min。每張切片加1滴或50 μL非免疫山羊血清,室溫下孵育10 min后直接甩去液體。每張切片加50 μL的第一抗體,室溫下孵育60 min,PBS沖洗 3次,各3~5 min。除去 PBS液,每張切片加 50 μL即用MaxVisionTM試劑,室溫下孵育 15 min,PBS沖洗 3次,各3 min。除去PBS液,每張切片加100 μL新鮮配制的DAB顯色液,作用5 min,顯微鏡下觀察。自來水沖洗,蘇木素復(fù)染,PBS或自來水沖洗返藍(lán),梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封固。設(shè)空白二甲雙胍組,用PBS液沖洗,不加1抗,其余各步驟與其他切片相同。
2.4.4 基因芯片檢測(cè) 取肝臟組織交由上海伯豪生物工程有限公司進(jìn)行Angilent大鼠全基因組表達(dá)譜芯片測(cè)試,芯片名稱為:Agilent Whole Rat Genome Oligo Microarray(4×44K)。
2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以(x±s)表示,組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析?;蛐酒捎蒙虾2郎锛夹g(shù)公司SAS在線分析系統(tǒng)進(jìn)行生物信息學(xué)分析,計(jì)算差異倍數(shù)值(fold change,F(xiàn)C)。
3.1 4 組大鼠血清 HDL、LDL、TG、CHOL 水平比較見表1。
表1 4 組大鼠血清 HDL、LDL、TG、CHOL 水平比較(x±s)mmol/L
3.2 肝臟HE染色 模型組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂,細(xì)胞胞漿疏松化,有些則呈氣球樣變,炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯,纖維組織增生,包繞匯管區(qū);二甲雙胍組和石斛合劑組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)稍紊亂,氣球樣變、炎細(xì)胞浸潤(rùn)較模型組明顯減少。見圖1。
圖1 4組大鼠肝臟HE染色圖(×40)
3.3 免疫組化檢測(cè)β-catenin 模型組β-catenin高表達(dá),并且可見部分細(xì)胞核出現(xiàn)表達(dá),大部分細(xì)胞核移位,脂肪變性較嚴(yán)重;二甲雙胍組有部分 βcatenin表達(dá)于細(xì)胞質(zhì);但細(xì)胞核未見β-catenin表達(dá),部分細(xì)胞核移位;石斛合劑組β-catenin表達(dá)量、核移位、脂肪變性少于二甲雙胍組。見圖2、表2。
圖2 4組大鼠肝臟β-catenin免疫組化圖(×400)
表2 4組大鼠肝臟β-catenin表達(dá)比較(x±s)
3.4 脂代謝相關(guān)基因芯片結(jié)果 見表3、4。判定標(biāo)準(zhǔn):FC值≥2的基因?yàn)楸磉_(dá)顯著上調(diào)基因,F(xiàn)C值≤0.5為表達(dá)顯著下調(diào)基因。
2型糖尿病的患者多數(shù)存在脂代謝紊亂,而高血糖和高血脂導(dǎo)致糖尿病的并發(fā)癥,例如動(dòng)脈粥樣硬化等,而動(dòng)脈粥樣硬化是糖尿病患者致死的首要原因[4],長(zhǎng)期的高血脂能降低機(jī)體各組織對(duì)胰島素的敏感性。因此,調(diào)節(jié)糖尿病脂代謝的紊亂相當(dāng)重要。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為糖尿病的病位在脾(胃)、肝、腎,多為虛實(shí)夾雜,即以陰虛或者氣陰兩虛為本,痰濁血瘀為標(biāo)。在疾病初期多以標(biāo)實(shí)為主,情志失調(diào),繼而痰濁化熱傷陰;后期以本虛為主,且多為陰陽兩虛,并兼有痰濁、瘀血,而痰濁和瘀血又相互影響,耗傷氣血、損傷臟腑[5]。 林蘭教授[6]認(rèn)為糖尿病分為三型:即陰虛熱盛、氣陰兩虛、陰陽兩虛,分別代表著糖尿病病程的早、中、晚三個(gè)時(shí)期,基本證候?yàn)闅怅巸商?,兼有血瘀,而陰虛則貫穿整個(gè)糖尿病的發(fā)病過程。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)臨床2型糖尿病本虛標(biāo)實(shí)的病機(jī)特點(diǎn),確立以標(biāo)本兼治、扶正祛邪為主的治療原則,先采用益氣、滋陰、活血,兼以生津、清熱的1、2號(hào)方,再佐以利濕泄?jié)岬?號(hào)方,扶正與祛邪分而治之,以免功效互抵,并注意在祛邪時(shí)不傷正。本研究通過對(duì)衰老糖尿病大鼠肝臟組織基因芯片的分析,旨在探索石斛合劑治療糖尿病,特別是調(diào)節(jié)肝臟脂代謝的相關(guān)通路,為石斛合劑治療糖尿病的機(jī)制研究提供方向。
表3 石斛合劑組對(duì)比模型組表達(dá)明顯下調(diào)的基因
表4 模型組明顯下調(diào)或上調(diào),經(jīng)石斛合劑治療后恢復(fù)正常的基因
通過對(duì)血清學(xué)的檢查發(fā)現(xiàn)經(jīng)石斛合劑治療后衰老糖尿病大鼠血清LDL、TG、CHOL水平顯著降低,HDL水平顯著升高?;蛐酒瑑蓛蓪?duì)比發(fā)現(xiàn),石斛合劑組對(duì)比模型組叉頭框蛋白Q1(forkhead box Q1,F(xiàn)OXQ1)、WNT1 誘導(dǎo)信號(hào)通道蛋白 2(WNT1 inducible signaling pathway protein 2,WISP2)基因表達(dá)顯著下調(diào);通過石斛合劑的治療,模型組對(duì)比正常對(duì)照組下調(diào)的低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白-5(low density lipoprotein receptor-related protein 5,LRP5)、無翅型MMTV整合位點(diǎn)家族成員7A(wingless-type MMTV integration site family,member 7A,WNT7A)基因恢復(fù)正常表達(dá),上調(diào)的WISP2基因恢復(fù)正常表達(dá)。FOXQ1能參與調(diào)節(jié)WNT/β-catenin信號(hào)通路,有研究表明,在肝癌的患者中FOXQ1呈高表達(dá),而當(dāng)FOXQ1沉默時(shí)可以抑制肝癌細(xì)胞血管的生成[7]。當(dāng)WISP2和其他WNT激活的標(biāo)志物表達(dá)增加時(shí),能增加肥胖、內(nèi)臟脂肪積累和胰島素抵抗[8]。WNT7A屬于WNT家族,能夠抑制細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[9]。LRP5屬于低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白,是WNT經(jīng)典通路中的一個(gè)受體,其能參與巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)吸收。WNT通路中的主要組成有配體如WNT家族分子、跨膜受體如LRP5、胞漿調(diào)節(jié)蛋白β-catenin等。β-catenin在WNT經(jīng)典通路中有著相當(dāng)重要的作用,有研究表明,WNT/βcatenin通路的活化不僅能增加病毒性肝炎患者病毒的表達(dá),還能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移,使肝癌的預(yù)后不良[10-12]。通過基因芯片的研究發(fā)現(xiàn)石斛合劑能使衰老糖尿病大鼠LRP5、WNT7A基因恢復(fù)到正常水平,將衰老糖尿病大鼠顯著上調(diào)的WISP2基因恢復(fù)到正常水平,提示石斛合劑可能主要是通過“糾偏”達(dá)到調(diào)控衰老糖尿病大鼠脂質(zhì)代謝的作用;通過石斛合劑的治療能夠降低FOXQ1基因表達(dá),提示石斛合劑可能具有抑制衰老糖尿病大鼠肝癌發(fā)生的作用。通過對(duì)免疫組化結(jié)果的分析發(fā)現(xiàn),石斛合劑組、二甲雙胍組β-catenin的表達(dá)量均顯著低于模型組,提示石斛合劑可能是通過調(diào)節(jié)WNT/β-catenin信號(hào)通路起到抑制肝臟癌變、減少內(nèi)臟脂肪積累等達(dá)到調(diào)節(jié)肝臟脂代謝的作用。
通過本研究我們發(fā)現(xiàn)石斛合劑能通過“糾偏”達(dá)到調(diào)節(jié)WNT/β-catenin信號(hào)通路的作用。通過對(duì)已知基因的研究發(fā)現(xiàn),石斛合劑能通過控制脂肪生成,增加脂肪酸的β氧化,促進(jìn)脂肪分解及脂肪酸的運(yùn)輸,通過調(diào)節(jié)WNT信號(hào)通路,從而降低血清LDL、TG、CHOL水平,升高 HDL水平,起到保護(hù)肝臟、減少肥胖、減輕內(nèi)臟脂肪積累、降低胰島素抵抗的作用,從而對(duì)糖尿病大鼠脂代謝起到調(diào)控的作用。
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