許 瑛，姚兆群，王 蘭，趙思峰

(1.新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲(chóng)害治理與植保資源利用自治區(qū)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/石河子大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，新疆石河子 832003；2.塔里木大學(xué) 植物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300 )

紅棗(ZizyphusjujubeMill)富含維生素、氨基酸、糖類、蛋白質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)成分，是集營(yíng)養(yǎng)保健與醫(yī)藥療效為一體的優(yōu)質(zhì)果品[1]。新疆南疆已成為中國(guó)重要的商品棗基地，紅棗種植對(duì)當(dāng)?shù)剞r(nóng)民增收發(fā)揮重要作用[2]。近年來(lái)?xiàng)椆诎卟≡谀辖t棗種植區(qū)普遍發(fā)生，輕者發(fā)病率達(dá)到10%左右，嚴(yán)重地塊甚至60%以上的果實(shí)發(fā)病，發(fā)病病果表面出現(xiàn)黑色斑塊，病組織深入果肉3～5 mm，易脫落，對(duì)紅棗產(chǎn)量和品質(zhì)均造成較大影響[3-4]。消費(fèi)者通常依據(jù)紅棗果品的大小、色澤、風(fēng)味、營(yíng)養(yǎng)、質(zhì)地等特征來(lái)評(píng)價(jià)紅棗品質(zhì)的優(yōu)劣，已有報(bào)道表明產(chǎn)地和年份對(duì)紅棗品質(zhì)有較大影響[5]，而合理密植、合理的水肥管理[6-8]、合理修剪及適期采收[9-10]等措施均可有效提高棗果內(nèi)在及外觀品質(zhì)。目前，對(duì)新疆棗果黑斑病的研究已有很多，主要集中在危害情況、病原鑒定、發(fā)生規(guī)律調(diào)查以及防治方法等方面[3-4]，而紅棗感染黑斑病后的品質(zhì)變化和食用安全性方面的研究則未見(jiàn)報(bào)道。棗果黑斑病的致病菌主要為鏈格孢菌(Alternariaalternata)[3-4]，已有大量文獻(xiàn)報(bào)道該菌可產(chǎn)生交鏈孢酚(Alternariol，AOH)、交鏈孢酚單甲醚(Alternariol monomethyl ether，AME)、交鏈孢烯(Altenuene，ALT)、交鏈孢菌酮酸(Tenuazonic acid，TeA)、AAL毒素(Alternariaalternatatoxin，AAL)、交鏈孢毒素(Altertoxin，ATXs)和騰毒素(Tentoxin，TEN)等70多種真菌毒素，其中AOH和AME對(duì)哺乳動(dòng)物具有強(qiáng)致癌性，且存在協(xié)同效應(yīng)[11-13]，而TeA已被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)列入有毒化學(xué)物質(zhì)，作為必須檢測(cè)對(duì)象[14]。2015年中國(guó)針對(duì)出口水果制訂鏈格孢菌毒素檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，但對(duì)紅棗棗果感染鏈格孢菌后毒素檢測(cè)辦法和標(biāo)準(zhǔn)目前尚未見(jiàn)報(bào)道[15]。

本研究以南疆產(chǎn)量較大的‘駿棗’和‘灰棗’2個(gè)品種為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)健康棗果和被鏈格孢菌感染不同發(fā)病程度棗果的外觀、著色、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、風(fēng)味等內(nèi)外品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行比較，同時(shí)對(duì)不同發(fā)病程度果實(shí)中鏈格孢菌毒素種類及數(shù)量進(jìn)行測(cè)定，最終評(píng)價(jià)棗果黑斑病對(duì)南疆紅棗品質(zhì)和食用安全性的影響。

1 材料與方法

1.1 材 料

棗果：2016年在新疆阿拉爾市農(nóng)科所實(shí)驗(yàn)棗園采集，棗園樹(shù)齡6 a，老棗股結(jié)果，栽培密度為0.6 m×1.5 m，灌水方式為滴灌，常規(guī)管理，采集品種有‘駿棗’和‘灰棗’。在果實(shí)脆熟期，分別從不同品種棗園隨機(jī)選取樹(shù)冠外側(cè)2～3 a生棗股上健康和感病果實(shí)樣品，將采集的紅棗在低溫冷藏條件下帶回實(shí)驗(yàn)室，備用。采集回來(lái)的‘駿棗’‘灰棗’棗果參考劉艷祥等[16]報(bào)道黑斑病病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)并略作修改后分級(jí)。0級(jí)：果面光潔，無(wú)病斑；1級(jí)：果面病變面積占總面積20%以下；2級(jí)：果面病變面積占總面積21%～40%；3級(jí)：果面病變面積占總面積41%～60%；4級(jí)：果面病變面積占總面積61%以上。各等級(jí)棗果隨機(jī)混勻用于后續(xù)各種指標(biāo)的測(cè)定。

試劑：交鏈格孢酚單甲醚(AME)和鏈格孢酚(AOH)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；細(xì)交鏈格孢菌酮酸(TeA)和交鏈孢烯(ALT)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于北京萊耀生物公司；L-亮氨酸、蒽酮、乙酸乙酯、茚三酮、抗壞血酸、乙酸乙酯、3,5-二硝基水楊酸、考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清蛋白質(zhì)、乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、乙腈等試劑購(gòu)于石河子市沃德生物試劑營(yíng)銷部。Xevo TQ/MS超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters公司)，配有AcquityUPLCBEH C18液相色譜柱(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)。

1.2 方 法

1.2.1 外在品質(zhì)測(cè)定 分別隨機(jī)選取20 顆不同病級(jí)的‘駿棗’和‘灰棗’棗果，用電子天平稱量單果質(zhì)量、數(shù)顯電子游標(biāo)卡尺測(cè)定果實(shí)縱經(jīng)、橫經(jīng)并計(jì)算其果形指數(shù)；使用GY4硬度計(jì)測(cè)定果肉硬度，每個(gè)果實(shí)去皮后隨機(jī)測(cè)定5次，取平均值；果皮色差使用色彩色差儀自動(dòng)檢測(cè)，采用“CIE Lab”表色系統(tǒng)，在D65/10光源下測(cè)定L*(亮度)，a*(紅色飽和度)和b*(黃色飽和度)，根據(jù)測(cè)定結(jié)果分別計(jì)算其色澤比(CIE)、色飽和度、色差(NBS)，每個(gè)果實(shí)測(cè)定4個(gè)果面及果實(shí)胴部，共計(jì)測(cè)定5個(gè)面；將20個(gè)果實(shí)烘干至恒量計(jì)算質(zhì)量含水量。

1.2.2 內(nèi)在品質(zhì)測(cè)定 分別隨機(jī)選取20 個(gè)黑斑病不同病級(jí)的‘駿棗’和‘灰棗’棗果，將單個(gè)紅棗去皮去核，果肉用混合冷凍球磨儀打碎，分別測(cè)定維生素C、蛋白質(zhì)、游離氨基酸、可溶性糖、還原糖、可滴定酸的含量，每個(gè)樣品重復(fù)3次。其中維生素C采用紫外快速測(cè)定法[17]，蛋白質(zhì)采用考馬斯亮藍(lán)G-205染色法，可溶性總糖采用蒽酮比色法，還原糖采用3,5二硝基水楊酸法，游離氨基酸采用茚三酮比色法[18-19]，可滴定酸采用酸堿滴定法測(cè)定[20]。

1.2.3 不同發(fā)病程度棗果中鏈格孢菌毒素檢測(cè) 毒素提?。悍謩e稱取上述各等級(jí)破碎果肉2 g，加入50 mL離心管中，加入φ=1%甲酸-乙腈溶液10 mL、冷水10 mL，旋渦震蕩10 min，繼續(xù)加4 g無(wú)水硫酸鎂、1 g氯化鈉震蕩10 min，5 000 r/min 離心5 min，輕輕吸取4 mL上清液與15 mL離心管中，加入0.2 g PSA、0.6 g無(wú)水硫酸鎂震蕩提取30 min，4 000 r/min離心5 min，輕取2.5 mL上清液使用水浴氮吹儀濃縮干燥，之后使用0.2 mL甲醇溶解，過(guò)濾，取該提取液到超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀用于鏈格孢霉毒素檢測(cè)。

毒素檢測(cè)條件：超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件色譜柱：Acquity UPLC BEH C18液相色譜柱(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(φ=0.1%甲酸)；離子化模式：電噴霧離子源，正離子模式(ESI+)；質(zhì)譜掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；毛細(xì)管電壓3.5 kV，錐孔電壓40 kV，離子源溫度150 ℃，霧化溫度500 ℃，脫溶劑氣流量1 000 L/h，錐孔氣流速50 L/h。4種鏈格孢霉毒素的監(jiān)測(cè)離子、錐孔電壓和碰撞電壓等質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

測(cè)定得到的數(shù)據(jù)采用Excel 2010處理，用SPSS 19.0進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)病嚴(yán)重度對(duì)果實(shí)外觀品質(zhì)的影響

2.1.1 對(duì)物理性狀的影響 與健康棗果相比，‘駿棗’和‘灰棗’不同發(fā)病程度棗果大小、果形指數(shù)、硬度、質(zhì)量含水量均存在顯著性變化(表2)。與健康‘駿棗’相比，隨著發(fā)病嚴(yán)重度的增加，駿棗單果質(zhì)量下降幅度為5.33%～45.61%；果實(shí)橫經(jīng)降低5.2%～13.4%，縱經(jīng)間無(wú)顯著差異；果形指數(shù)增加1.39%～12.5%；硬度降低11.4%～56.0%；質(zhì)量含水量降低1.43%～18.1%。與健康‘灰棗’相比，發(fā)病‘灰棗’鮮果質(zhì)量略有增加，增加幅度為7.5%～20.0%；果實(shí)縱徑增加0.08%～15.40%，橫經(jīng)無(wú)顯著變化；果形指數(shù)增加4.17%～10.42%；硬度下降13.88%～39.04%；質(zhì)量含水量間也存在顯著差異，發(fā)病越嚴(yán)重質(zhì)量含水量越低，1～4級(jí)灰棗分別減少11.05%～23.15%。

2.1.2 對(duì)果實(shí)色度的影響 紅棗感染棗果黑斑病后棗果色度也發(fā)生明顯變化(表3)。其中L*表示果皮色澤的明暗程度，L*越大，果實(shí)越亮，a*表示紅色與綠色相比的程度，a*值越大，果實(shí)紅色越深，b*表示黃色與藍(lán)色的相比程度，b*值越大，果實(shí)黃色越深，色澤比h是色調(diào)參數(shù)中的1個(gè)指標(biāo)，當(dāng)h>1說(shuō)明果實(shí)偏紅偏暗，色飽和度C表示色彩的純潔性，C值越大，表示果實(shí)顏色越鮮艷，△Eab是L*、a*、b*綜合比較的體現(xiàn)，直觀的反應(yīng)果實(shí)顏色差異。健康駿棗相比，發(fā)病駿棗L*值降低0.27%～15.13%；除1級(jí)病棗果a*值略有增加外，2級(jí)、3級(jí)、4級(jí)棗果a*值下降12.07%～32.91%；b*值下降2.26%～49.71%；色澤比h增加6.52%～45.65%；色飽和度C降低0.20%～34.06%；色差值降低0.19%～20.47%。與健康灰棗相比，發(fā)病灰棗L*值降低2.57%～12.74%；a*值除1級(jí)病棗果略有增加外，2級(jí)、3級(jí)、4級(jí)棗果a*值下降4.06%～8.28%；b*值下降5.79%～40.89%；色澤比h增加10.89%～63.28%；色飽和度C下降0.53%～18.29%；色差值降低1.43%～14.27%。

2.2 對(duì)果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)的影響

紅棗感染棗果黑斑病以后，紅棗營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)及口感等相關(guān)品質(zhì)均會(huì)發(fā)生明顯改變(表4)。與健康‘駿棗’相比，發(fā)病‘駿棗’維生素C質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低29.61%～75.99%；可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加4.05%～84.39%；游離氨基酸增加11.02%～85.040%；1～3級(jí)病果可溶性糖含量分別增加8.47%～20.34%，但4級(jí)降低33.19%；1～3級(jí)病果還原糖含量增加9.35%～27.94%，但4 級(jí)降低30.57%；可滴定酸含量降低8.77%～15.79%；1～3級(jí)病果糖酸比增加20.91%～44.21%，4級(jí)病果下降22.71%。與健康‘灰棗’相比，1～3級(jí)發(fā)病‘灰棗’中維生素C質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別降低21.77%～86.31%，4級(jí)病棗果中則未檢測(cè)到維生素C；發(fā)病‘灰棗’中可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加2.77%～62.21%；游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加7.90%～76.32%；1～3級(jí)病果可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別增加1.76%～16.19%，但4級(jí)降低26.91%；1～3級(jí)病果還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加2.63%～33.68%，但4級(jí)降低3.62%；可滴定酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低0%～18.52%；1～3級(jí)病果糖酸比增加5.39%～41.63%，4級(jí)病果下降24.21%。

表1 4種鏈格孢霉毒素的串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定參數(shù)Table 1 MS/MS parameters for 4 Alternaria mycotoxins

表2 不同發(fā)病嚴(yán)重度棗果物理性狀比較Table 2 Comparison of different levels of physical propertie in Jujube fruits

2.3 不同發(fā)病程度棗果中毒素的檢測(cè)

棗果黑斑病發(fā)病后在病棗果中可以檢測(cè)到TeA、AME和AOH 3種鏈格孢菌產(chǎn)生的毒素，沒(méi)有檢測(cè)到ALT毒素(表5)。在檢測(cè)出的3種

表3 不同發(fā)病嚴(yán)重度棗果色度比較Table 3 Comparison of different levels of chroma in jujube fruits

表4 不同發(fā)病嚴(yán)重度棗果內(nèi)在品質(zhì)比較Table 4 Comparison of different levels of internal quality in jujube fruits

表5 不同發(fā)病嚴(yán)重度棗果毒素種類及數(shù)量Table 5 The type and amount of mycotoxins in different disease severity jujube fruit

毒素中，TeA毒素的檢出率最高且檢出量也最大，在發(fā)病級(jí)數(shù)為1～4級(jí)的‘駿棗’中，TeA毒素檢出量分別為6.72～217.42 mg/kg，‘灰棗’為28.58～135.40 mg/kg，在1份健康‘灰棗’檢測(cè)到TeA，可能是樣品污染所致；AOH毒素檢出率次之，其在發(fā)病‘駿棗’的檢出量分別為0.04～0.28 mg/kg，在發(fā)病‘灰棗’的檢出量為0.62～2.24 mg/kg；AME毒素在發(fā)病‘駿棗’中的檢出量為0.73～3.81 mg/kg，在‘灰棗’中的檢出量為0.68～3.06 mg/kg。3種毒素總體上呈現(xiàn)出隨著發(fā)病嚴(yán)重度的增加，對(duì)人體有害的鏈格孢菌毒素含量越來(lái)越高。

3 討 論

‘駿棗’和‘灰棗’作為南疆主栽品種，其具有風(fēng)味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)，深受消費(fèi)者喜愛(ài)。而黑斑病近年來(lái)發(fā)生日益嚴(yán)重，棗果感染黑斑病之后嚴(yán)重影響產(chǎn)量和品質(zhì)。本研究通過(guò)對(duì)不同發(fā)病級(jí)數(shù)的‘駿棗’和‘灰棗’果實(shí)外觀品質(zhì)、內(nèi)在品質(zhì)、毒素種類及數(shù)量等指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定分析。研究表明：發(fā)病‘駿棗’鮮果質(zhì)量、硬度和質(zhì)量含水量均降低，但果形指數(shù)增加；發(fā)病灰棗鮮果質(zhì)量、果形指數(shù)增加，硬度和質(zhì)量含水量降低。2種棗果發(fā)病后果皮L*(亮度)、C(色飽和度)和△Eab(色差)等指標(biāo)均顯著降低，果實(shí)偏紅暗色。光照可以提高果皮的色度[21]，趙曉梅等[22]研究庫(kù)爾勒香梨萼端黑斑病對(duì)其品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)同一地區(qū)感病梨L 值小于健康梨，果實(shí)硬度降低。

2種棗果發(fā)病后維生素C質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低，在4級(jí)‘灰棗’中未檢測(cè)到維生素C?？扇苄缘鞍踪|(zhì)和游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著加，其中2級(jí)棗果增加最多，可溶性蛋白質(zhì)‘駿棗’增加84.4%，‘灰棗’增加62.2%，游離氨基酸‘駿棗’增加85% ‘灰棗’增加76.3%。病棗中可溶性糖和還原糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在顯著差異，‘駿棗’中1～3級(jí)顯著增加，4級(jí)顯著降低，‘灰棗’中1～2級(jí)顯著增加，4級(jí)顯著降低。病棗中可滴定酸含量降低，‘駿棗’糖酸比為：2級(jí)>1級(jí)>3級(jí)>0級(jí)>4級(jí)，‘灰棗’為：2級(jí)>1級(jí)>3級(jí)>0級(jí)>4級(jí)。糖酸比是風(fēng)味指標(biāo)的綜合體現(xiàn)，健康棗果小于病棗，可能與棗果成熟程度和采樣存在誤差有關(guān)。

在2種發(fā)病棗果中檢測(cè)到3種毒素，分別為TeA、AME、AOH，未檢測(cè)到ALE。在健康‘駿棗’中檢測(cè)到TeA，‘灰棗’中未檢測(cè)到毒素。陳月萌等[23]研究表明，鏈格孢霉毒素在有霉變的水果中存在較為普遍，在有霉變的蘋果中檢測(cè)到AOH和AME，在桃中檢測(cè)到ALT和AOH，但在新鮮蘋果、桃、梨中均未檢出鏈格孢毒素。而本試驗(yàn)在1份健康棗果樣品中檢測(cè)到TeA，可能與采樣誤差或鏈格孢菌潛伏侵染產(chǎn)生毒素有關(guān)，其具體原因需要進(jìn)一步研究確定。蔣黎艷等[24]研究表明，柑橘感染鏈格孢菌后各部位產(chǎn)生毒素含量會(huì)從發(fā)病部位擴(kuò)散到健康部位累積，這與本試驗(yàn)結(jié)果相一致，棗果發(fā)病越嚴(yán)重毒素含量越高，但病斑面積達(dá)到61%以上(4級(jí)病棗)毒素含量相對(duì)減少，這可能與毒素代謝有關(guān)。本試驗(yàn)在病棗中檢測(cè)到TeA最大達(dá)217.42 mg/kg，AME為 3.81 mg/kg，AOH為 2.24 mg/kg，而Smith等[25]研究也發(fā)現(xiàn)，小鼠靜脈注射TeA鈉鹽時(shí)半致死劑量(LD50)為115～162 mg/kg。目前，暫未有棗果中鏈格孢毒素的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)及含量限定，所以在鮮棗加工、采后干制儲(chǔ)藏等風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中應(yīng)引起關(guān)注和重視。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明：與健康棗果相比，感病紅棗果實(shí)外形、硬度、質(zhì)量含水量等物理品質(zhì)均有不同程度的下降，棗果色度、色飽和度等外觀形態(tài)品質(zhì)下降，與此同時(shí)棗果中的維生素C質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低，因鏈格孢菌代謝或病菌侵入后促進(jìn)棗果加速老熟，導(dǎo)致游離氨基酸、可溶性糖、還原糖含量、糖酸比等指標(biāo)顯著增加。在發(fā)病的‘灰棗’、‘駿棗’中均中檢測(cè)到TeA、AME和AOH 3種毒素。綜上所述，棗果黑斑病不僅僅造成減產(chǎn)，還可嚴(yán)重影響紅棗的外觀和內(nèi)在果實(shí)品質(zhì)，其致病菌鏈格孢菌產(chǎn)生的毒素對(duì)人體健康也有較大危害。為了減少黑斑病對(duì)紅棗產(chǎn)業(yè)的危害，增加果農(nóng)的經(jīng)濟(jì)效益，在生產(chǎn)上應(yīng)該加強(qiáng)栽培管理和及時(shí)防治，減少該病害進(jìn)一步擴(kuò)展，同時(shí)在紅棗采收時(shí)應(yīng)嚴(yán)格把住質(zhì)量關(guān)，對(duì)發(fā)生黑斑病的棗果，要及時(shí)篩除掉，不能用于進(jìn)一步的加工和銷售。

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7.2.12根腐?、偌訌?qiáng)管理，保持樹(shù)體生長(zhǎng)健壯。多施有機(jī)肥，病樹(shù)可施入賽眾28微肥2～3公斤，使土壤透氣性良好，根系在生長(zhǎng)良好的條件下抗病力強(qiáng)。盡量不用山洪等污水灌溉。②加強(qiáng)早期落葉病、腐爛病的防治，避免引起樹(shù)體衰弱，誘發(fā)根腐病。③對(duì)發(fā)病樹(shù)及周圍可被侵染的植株，用甲基硫菌靈800倍，硫酸銅300～400倍液灌根。連片發(fā)病時(shí)有必要挖深60厘米、寬20～30厘米的隔離溝，防止傳播蔓延。

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